Изучение генетики болезни фабри в Ленкорань-Астаринском экономическом районе (Азербайджан)

Бюллетень науки и практики / Bulletin of Science and Practice

УДК 616-056.7                                      

Впервые в Ленкорань-Астаринском регионе Азербайджанской Республики проведены популяционно-генетические исследования по выявлению и изучению генетики болезни Фабри. Для скринига пациентов с болезнью Фабри использовали метод определения активности фермента альфа-галактозидаза А и количественного определения глоботриазилсфингозина методом жидкостной масс-спектроскопии. У больных по клиническим показаниям был произведен забор крови на DBS карты (Dry Blood Sample). Обследованные пациенты были распределены следующим образом: из Астаринского района -16, Масаллинского - 33, Ленкоранского - 17 и Лерикского - 10 пациентов. Уровень дефицита фермента альфа-галактозидазы А у гемизиготных мужчин варьировал в пределах 0,0

мкмол/л/ч-2,0 мкмол/л/ч, в среднем 1,0 мкмол/л/ч (Н ≥ 15,3 мкмoл/л/ч). Количество Lyso-Gb3 было характерно повышено для болезни Фабри и варьировало в пределах 106,0нг/мл-218,0 нг/мл, при среднем значении 112,2 нг/мл (Н≤ 1,8). Что касается гетерозиготных женшин, то активность фермента альфа-галактозидазы А также была снижена и варьировала в вределах 2,0 мкмол/л/ч-4,3 мкмол/л/ч, в среднем 3,67 мкмол/л/ч (Н≥ 15,3 мкмoл/л/ч). Следовательно, наблюдали повышенные значения Lyso-Gb3 варьирующие в пределах 8,3 нг/мл-20,0 нг/мл, при среднем значении 15,0 нг/мл (Н≤ 1,8). Клинико-генеологический анализ, проведенный у членов семьи пробанда Т.И. из Масаллинского района, дополнительно установил семь женщин и троих мужчин с подозрением на болезнь Фабри. В большой семье из 28 человек выявлено 12 больных с диагнозом болезнь Фабри, внутрисемейная частота которой составила 42,86%. Идентификацию мутации гена GLA проводили методом секвенирования нового поколения (NGS). Идентифицирована мутация интрона 5 (NM_000169.2: c.801+3A>G). Согласно «Руководству ACMG*» идентифицированная нами мутация по патогенности относится к 1 классу, в соответствие в Рекомендациями Centogene.

Болезнь Фабри (БФ), ангиокератома (Corporis diffusum), болезнь Андерсона-Фабри редкое генетически детерминированное заболевание с Х-сцепленным типом наследования, из группы лизосомных болезней накопления [1, 2].

В 1898 году Фабри описал 13-летнего мальчика с нодулярной пурпурой, у которого, в последствии, развилась альбуминурия. Данный клинический случай был классифицирован автором как один из вариантов диффузной ангиокератомы. В том же году Андерсон описал 39-летнего мужчину с ангиокератомой, протеинурией, деформациями пальцев рук, варикозным расширением вен и лимфатическим отеком [3-6].

Причиной возникновения БФ являются мутации гена GLA, кодирующего фермент альфа-галактозидазу А (GLA; EC 3.2.1.22). Ген GLA картирован на длинном плече хромосомы Хq22.1, имеет размер около 12 тысяч пар нуклеотидов и состоит из 7 экзонов. К настоящему времени идентифицировано более 600 вариантов в гене GLA, в том числе около 500 патогенных мутаций, изменяющих свойства и стабильность альфа -галактозидазы А [7, 8].

Большинство мутаций являются уникальными для каждой семьи. БФ. Первичным биохимическим дефектом при БФ является недостаточность фермента альфа-галактозидаза А, который отщепляет терминальный остаток α-галактозы олигосахаридной цепи нейтральных гликосфинголипидов. Недостаточность фермента приводит к накоплению в лизосомах разных клеток (эндотелиальные и гладкомышечные клетки сосудов, эпителиальные клетки большинства органов, центральной нервной системы, сердца) гликосфинголипидов [9-11].

При болезни Фабри наблюдается нарушение потоотделения, быстрая утомляемость и непереносимость физических нагрузок, ангиокератомы, воронковидная кератопатия, нарушения функции сердца, почек, мозга и нервной системы, проблемы в психоэмоциональной сфере. На современном этапе накоплено достаточно данных, чтобы считать тип наследования болезни Фабри X-сцепленным доминантным с неполной пенетрантностью у женщин [12, 13].

Распространенность наследственной болезни Фабри составляет от 1 на 40 000 до 1 на 120 000 живых новорожденных, и является одной из наиболее распространенных лизосомных болезней накопления после болезни Гоше. Встречается во всех расовых группах и возникает с частотой 1:117000 в Австралии, 1:476000 в Нидерландах, 1:40000-60000 мужчин в США [14-16].

Следует с сожалением отметить, что до недавнего времени болезнь Фабри, из-за сложности диагностики, недостаточно изучена среди больных у населения Республики.

Следовательно, сегодня из-за доступности молекулярно-генетических методов диагностики, целью наших иследований является изучение генетики болезни Фабри у населения Ленкорань-Астаринского региона Азербайджанской Республики.

Материал и методы

Экспериментальный материал собран во время экспедиционных работ в Центральных районных больницах Астаринского, Ленкоранского, Масаллинского и Лерикского районов, расположенных в юго-восточной части Азербайджанской Республики. У 76 больных по клиническим показаниям был произведен забор крови на DBS карты (Dry Blood Sample) и отправлены в лабораторию для дальнейших генетических исследований.

Пациенты были распределены следуюшим образом: 16 человек из Астаринского района, 33 из Масаллинского, 17 из Ленкоранского и 10 пациентов из Лерикского районов. Высушенные пятна крови очень удобны для скрининговых исследований в экспедиционных условиях, так как сухие пятна крови легко получить, хранить и транспортировать в лабораторию. В дальнейших исследованиях использовали также жидкую кровь (в пробирке с гепарином или ЭДТА) .

Активность фермента альфа-галактозидазу А определяли методом жидкостной масс-спектроскопии. Для уточнения диагноза нами был использован новый тест лля количественного определения глоботриазилсфингозина (Lyso-GB3, Lyso-GL3) более наглядно, нежели глоботриазилцерамида (GB3, GL3) [17].

Ген GLA в образце ДНК, полученном из взятой периферической крови пациента, исследовали методом секвенирования нового поколения. «Более 99% кодирующих областей этих генов были изучены с глубиной чтения не менее 50X. Средняя глубина чтения составляет 1559 показаний. В анализ были включены соединения экзон-интрон (±10 п.н.). Классификацию патогенности полученных данных проводили согласно «Руководству ACMG*».

Результаты и их обсуждение

Генетический скрининг активности фермента альфа-галактозидазы 76 больных с диагнозом кардиомиопатия выявил шесть пациентов с дефицитом данного фермента, из которых 4 мужчины и 2 женщины. Уровень активности альфа-галактозидазы у мужчин был значительно снижен и варьировал в пределах 0,0 мкмол/л/ч-0,8 мкмол/л/ч при норме ≥ 15,3 мкмол/л/ч. Для подтверждения диагноза использован тест Lyso-Gb3, что подтвердил ранее поставленный диагноз ферментным анализом. Уровни Lyso-Gb3 у мужчин варьировали в предах 106,0 нг/мл-117,0 нг/мл при норме ≤ 1,8 нг/мл. При болезни Фабри активность альфа-галактозидазы в крови у мужчин всегда снижена.

У женщин уровень активности фермента альфа-галактозидазы был занижен и составлял 1,2 мкмол/л/ч и 1,9 мкмол/л/ч, соответственно. Также наблюдали повышение количества Lyso-Gb3 8,3-15,6 нг/мл при норме ≤ 1,8 нг/мл, что подтверждает поставленный диагноз.

Использование теста Lyso-Gb3 позволяет не только разъяснить трудные диагностические случаи болезни, но и определить классическую или неклассическую форму заболевания, а также для мониторинга состояния пациента [17-18].

Трое пациентов — двое мужчин и одна женщина были выявлены в Масаллинском районе. Все трое больных были представителями одной большой семьи. Двое пациентов (мужчина и женщина) из Астаринского и один мужчина из Ленкоранского районов. Клинико- генеалогический анализ членов семей больных пациентов позволил нам дополнительно установить семь женщин и троих мужчин с подозрением на болезнь Фабри. Для всех членов семей с подозрением на болезнь Фабри была взята кровь и проведен анализ на активность фермента альфа-галактозидазы и количественный анализ на Lyso-Gb3.

Результаты ферментного и Lyso-Gb3 анализов семьи Т.И. из Масаллинского района представлены в Таблице.

Таблица

РЕЗУЛЬТАТЫ ФЕРМЕНТНОГО И LYSO-GB3. АНАЛИЗОВ У ЧЛЕНОВ СЕМЬИ ПРОБАНДА Т.И.

Пациенты	Дата рождения	Пол	Альфа-галактозидаза Н ≥15.3 мкмол/л/ч	lyso-Gb3 Н≤ 1,8. нг/мл	Мутация гена GLA	Генотип
T.И.	03.06.87	муж	0.8 мкмол/л/ч	106.0 нг/мл	801+3A>G	Гемизигота
T.A.	21.06.86	муж	0.8 мкмол/л/ч	117.0 нг/мл	801+3A>G	Гемизигота
T.Г	19.08.62	жен	3.2 мкмол/л/ч	15.6 нг/мл	801+3A>G	Гетерозигота
A.Г.	06.09.56	жен	2.0 мкмол/л/ч	8.3 нг/мл	801+3A>G	Гетерозигота
M.А.	20.07.12	муж	2.0 мкмол/л/ч	109.0 нг/мл	801+3A>G	Гемизигота
K.Э.	16.08.75	жен	3.0 мкмол/л/ч	13.0 нг/мл	801+3A>G	Гетерозигота
K.A.	28.07.07	жен	4.0 мкмол/л/ч	11.0 нг/мл	801+3A>G	Гетерозигота
Л.И.	31.08.51	жен	4,1 мкмол/л/ч	19.0 нг/мл	801+3A>G	Гетерозигота
K.С.	12.06.78	муж	0.0 мкмол/л/ч	218.0 нг/мл	801+3A>G	Гемизигота
K.Л.	20.07.53	муж	1.4 мкмол/л/ч	211.0 нг/мл	801+3A>G	Гетерозигота
A.A.	29.05.17	жен	4.3 мкмол/л/ч	20.0 нг/мл	801+3A>G	Гетерозигота
K.Ф.	15.05.03	жен	4.1 мкмол/л/ч	18.0 нг/мл	801+3A>G	Гетерозигота

Уровень дефицита фермента альфа-галактозидазы у гемизиготных мужчин варьировал в пределах 0,0 мкмол/л/ч-2,0 мкмол/л/ч и в среднем составил 1,0 мкмол/л/ч (Н ≥ 15,3 мкмол/л/ч). Количество Lyso-Gb3 было характерно для болезни Фабри значительно повышено и варьировало в пределах 106,0нг/мл-218,0 нг/мл, пр и среднем значении 112,2 нг/мл (Н≤1,8).

Что касается гетерозиготных женщин, активность фермента альфа-галактозидазы также была снижена и варьировала в пределах 2,0 мкмол/л/ч-4,3 мкмол/л/ч, в средней 3,67 мкмол/л/ч (Н ≥ 15,3 мкмол/л/ч). Следовательно, наблюдали повышенные значения Lyso-Gb3, варьирующие в пределах 8,3 нг/мл-20,0 нг/мл, при среднем значении 15,0 нг/мл

При болезни Фабри активность альфа-галактозидазы в крови у мужчин всегда снижена, а (Н≤1,8).у женщин активность фермента может быть около нижней границы нормы, чуть ниже ее или нормальной, из-за чего ферментный анализ для женщин не показателен в отношении наличия/отсутствия болезни Фабри. Следует отметить, что в наших исследованиях у всех женщин-гетерозигот уровень активности фермента был значительно снижен.

Следуюшим этапом наших исследований была молекулярная диагностика гена GLA у всех членов семьи с биохимически установленным диагнозом болезни Фабри.

Образцы ДНК, полученные из высушенных пятень крови (DBS карт), а также из периферической крови больных, исследовали методом секвенирования нового поколения (NGS). «Более 99% кодирующих областей этих генов были изучены с глубиной чтения не менее 50X. Средняя глубина чтения составляло 1559 показаний. В анализ были включены соединения экзон-интрон (±10 п.н.). Классификацию патогенности полученных данных проводили согласно «Руководству ACMG*». Для всех испытуемых идентфицирована мутация GLA гена. Замена трех нуклеотидов аденини на нуклеотид гуанин в 801 позиции интрона 5 (NM_000169.2:c.801+3A>G). Согласно «Руководству ACMG*», идентифицированная нами мутация NM_000169.2:c.801+3A>G по патогенности относится к классу 1 [19].

Мужчины имели гемизиготный генотип, все женщины являлись гетерозиготными носителями данной мутации. Результаты молекулярно-генетических анализов представлены в таблице №1.

Вариант GLA c.801+3A>G предварительно заявлен как разрушающий высоко законсервированный донорский сплайс сайт интрона 5. В соответствие с HGMD Professional 2019.1, этот вариант предварительно описан авторами Shabbeer et al., 2006 (PMID: 16595074) как вызывающий заболевание Фабри. В списке ClinVar он есть и обозначен как патогенный (в клиническом тестировании значится как Variation ID: 197639). Он классифицируется как патогенный (класс 1) в соответствие в Рекомендациями Centogene и ACMG.

Составлена большая родословная для семьи Т.И., объединяющая 28 членов семьи в четырех поколениях, в которой 12 (5 мужчин и 7 женщин) имели болезнь Фабри (Рисунок). Болезнь Фабри, внутрисемейная частота которой составила 42,86%.

Рисунок. Родословная семьи Т.И.

Таким образом, для изучения генетики болезни Фабри у населения Ленкорань-Астаринского региона Азербайджанской Республики нами собран экспериментальный материал во время экспедиционных работ в Центральных районных больницах Астаринского, Ленкоранского, Масаллинского и Лерикского районов. У 76 больных по клиническим показаниям и с диагнозом кардиомиопатия был произведен забор крови на DBS карты. На основании активности фермента альфа-галактозидазы и количества Lyso-Gb3 в Масаллинского районе у 12-ти пациентов выявлена болезнь Фабри. Выявлено по двое больных из Ленкоранского и Астаринского районов. Для больных из Масаллинкого района идентфицирована мутация GLA гена. Замена трех нуклеотидов аденини на нуклеотид гуанин в 801 позиции интрона 5 (NM_000169.2:c.801+3A>G). Согласно «Руководству ACMG*» идентифицированная нами мутация NM_000169.2:c.801+3A>G по патогенности относится к классу 1. Обсуждаются пути профилактики болезни Фабри для семей репродуктивного возраста.

Выводы

• 1.    Впервые в Азербайджанской Республике в большой семье из 28 человек выявлено 12 больных с диагнозом Болезнь Фабри и изучена генетика гена GLA.

• 2.    Диагностику Болезни Фабри следует проводить с определения активности фермента альфа-галактозидаза и количественного определения глоботриазилсфингозина. При этом активность фермента альфа-галактозидаза бывает ниже, а количество глоботриазилсфингозина выше нормы.

• 3.    Идентфицирована замена трех нуклеотидов аденин на нуклеотид гуанин в 801 позиции интрона 5  (NM_000169.2:c.801+3A>G). Согласно «Руководству ACMG*»,

• 4.    Обсуждаются пути профилактики болезни Фабри в виде пренатальной диагностики для семей с генетическим риском.

идентифицированная нами мутация по патогенности относится к классу 1, в соответствие в Рекомендациями Centogene и ACMG.