Изучение иммунотоксичности сухого экстракта из клубней зопника клубненосного

Одним из обязательных этапов доклинических исследований новых лекарственных средств является изучение их влияния на функциональную активность иммунной системы лабораторных животных.

Основная задача доклинического изучения влияния потенциальных лекарственных средств на иммунную систему состоит в том, чтобы в ходе эксперимента над животными доказать или исключить возможность развития иммунотоксического действия, вызванного фармакологическим средством или его метаболитами. Под иммунотоксическим действием понимают модифицирующее влияние фармакологических средств на иммуногенез, включая иммуносупрессию и гиперстимуляцию иммунитета, способное привести к снижению резистентности организма к инфекции, повышению риска онкологических заболеваний, развитию аутоиммунной патологии и аллергизации организма [3; 6].

Предложенный подход к оценке иммунотоксического действия фармакологических средств заключается в исследовании ряда интегральных иммунологических функций, позволяющих с учетом результатов гематологических и морфологических исследований лимфоидных органов оценить возможный риск при применении нового фармакологического средства [2; 4].

Объектом исследования явилось перспективное иммуномодулирующее средство — сухой экстракт из клубней зопника клубненосного Phlomis tuberosa (L.) Moench. Данный вид произрастает на территории России и за рубежом: в Центральной и Восточной Европе, широко распространен в умеренном климате Азии [5]. Зопник клубненосный является ценным лекарственным растением, клубни которого широко применяются в традиционной и народной медицине как ранозаживляющее и общеукрепляющее средство [8]. В литературе известно, что экстракт надземной части зопника клубненосного обладает гепатопротективными свойствами [7], эфирный и спиртовый экстракты надземной части проявляют цитотоксическую активность в отношении клеток линии P388 (лейкоз) и асцитного рака Эрлиха [1].

Цель исследования. Изучить иммунотоксические свойства сухого экстракта из клубней зопника клубненосного при внутрижелудочном введении.

Материалы и методы исследования

Иммунотоксическое действие сухого экстракта из клубней зопника клубненосного (ЭЗК) изучено на мышах-самцах линий СВА и F1 (СВА×С57В1/6) массой 18–20 г. Исследование проведено в соответствии с «Методическими указаниями по оценке иммунотоксического действия фармакологических веществ» [6]. Животных распределяли по группам, используя при рандомизации в качестве основного критерия массу тела (отклонение значений массы тела в пределах группы составило не более 10 %). Количество животных в каждой экспериментальной группе — 10. Для оценки иммунотоксического действия ЭЗК вводили в экспериментально-терапевтической дозе 200 мг/кг массы тела перорально в течение 14 дней 1 раз в сутки. Рабочие разведения ЭЗК готовили в день введения. Интактная группа животных получала по аналогичной схеме в соответствующем объеме очищенную воду. Для оценки иммунотоксических свойств исследовали показатели гуморального, клеточного и макрофагального звеньев иммунитета мышей.

Мышей умерщвляли с помощью дислокации шейных позвонков, извлекали тимус и селезенку, взвешивали на торсионных весах и рассчитывали отношение их массы к массе тела мыши в %. Для определения клеточности лимфоидные органы гомогенизировали в среде 199. Суспензию клеток отделяли от элементов стромы фильтрованием через капроновый фильтр и 3 раза отмывали от частиц жировой ткани центрифугированием при 200 град. в течение 5 минут. При подсчете ядросодержащих клеток (ЯСК) каплю клеточной суспензии для освобождения от сопутствующих эритроцитов помещали в 3-процентный раствор уксусной кислоты с генцианвиолетом (0,01 %) и вносили в камеру Горяева [6].

Состояние клеточного звена иммунного ответа оценивали в реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) согласно стандартной методике локальной ГЗТ [6]. Мышей сенсибилизировали внутрибрюшинным введением 0,1-процентной взвеси эритроцитов барана (ЭБ) в физиологическом растворе. На 4-е сутки под подошвенный апоневроз задней лапки вводили разрешающую дозу антигена — 50 мкл 50-процентной взвеси ЭБ. В контрлатеральную лапку инъецировали физиологический раствор в том же объеме. Оценку реакции ГЗТ проводили спустя 24 часа по разнице массы опытной (Pо) и контрольной (Рк) лапок.

Состояние гуморального иммунитета оценивали по количеству антителообразующих клеток (АОК), определяемых методом локального гемолиза по A. J. Cunningham (1965) [9]. Мышей иммунизировали внутрибрюшинно ЭБ в дозе 2×108 клеток/мышь. Величину иммунного ответа оценивали по числу антителообразующих клеток (АОК) на селезенку и на 106 ядросодержащих клеток (ЯСК) на 5-е сутки после иммунизации.

Состояние макрофагального звена иммунного ответа оценивали в реакции фагоцитоза перитонеальных макрофагов в отношении частиц коллоидной туши. Оптическую плотность лизата клеток перитонеального экссудата, отражающую количество туши, поглощенной перитонеальными макрофагами, определяли при длине волны 620 нм [6].

Результаты обрабатывались общепринятыми методами вариационной статистики и выражались в виде среднеарифметической (М) и ее стандартной ошибки (m). Применялись критерии непараметрической статистики Манна-Уитни (U). Обработка полученных данных производилась с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.

Результаты исследования и их обсуждение

Лимфоидные органы (тимус и селезенка) экспериментальных животных взвешивали и определяли относительную массу и количество ЯСК (клеточность). Введение ЭЗК не сопровождалось изменениями величины относительной массы и клеточности тимуса и селезенки у животных опытной группы. Размеры и форма селезенки и тимуса у животных опытной группы не отличались от таковых в интактной группе (табл. 1). Полученные данные позволили сделать вывод, что введение ЭЗК в дозе 200 мг/кг не привело к изменению массы и клеточности тимуса и селезенки.

Таблица 1 Относительная масса и клеточность тимуса и селезенки мышей при введении сухого экстракта зопника клубненосного

Группы	Исследуемые органы
	Тимус		Селезенка
	Относительная масса, %	Клеточность, кол-во ЯСК в 1 мг органа, ×106	Относительная масса, %	Клеточность, кол-во ЯСК, в 1 мг органа, ×106
Интактная (n = 10)	0,057 ± 0,003	35,6 ± 2,7	0,77 ± 0,023	104 ± 4,8
ЭЗК (n = 10)	0,052 ± 0,004	33,2 ± 3,1	0,74 ± 0,061	96 ± 5,8

Из данных, представленных в таблице 2, следует, что введение животным исследуемого средства не повлияло на фагоцитарную активность макрофагов. Фагоцитарный индекс значимо не изменялся в группе животных, которым вводили ЭЗК по сравнению с данными в интактной группе. Таким образом, введение ЭЗК экспериментальным животным не оказало влияния на изменение функциональной активности макрофагов.

Таблица 2 Влияние сухого экстракта зопника клубненосного на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов

Группы	Фагоцитарный индекс, %
Интактная (n = 10)	36,95 ± 1,58
ЭЗК (n = 10)	33,56 ± 0,03

Введение животным ЭЗК не оказало влияния на интенсивность клеточного иммунного ответа. Индекс реакции ГЗТ у животных, которым вводили ЭЗК, существенно не отличался от такового интактной группы (табл. 3).

Таблица 3

Влияние сухого экстракта зопника клубненосного на реакцию гиперчувствительности замедленного типа

Группы	Индекс реакции ГЗТ, %
Интактная (n = 10)	38,96 ± 3,12
ЭЗК (n = 10)	34,32 ± 2,87

Данные эксперимента, представленные в таблице 4, свидетельствуют о том, что введение ЭЗК не влияет на развитие антителообразования у мышей: абсолютное и относительное число АОК существенно не изменилось по сравнению с данными в интактной группе.

Влияние сухого экстракта зопника клубненосного на антителообразование

Таблица 4

Группы	Абсолют. число АОК	АОК на 106 спленоцитов
Интактная (n = 10)	40872 ± 3105	348,3 ± 30,8
ЭЗК (n = 10)	37602 ± 2393	322,7 ± 29,5

Заключение

Изучение иммунотоксических свойств сухого экстракта зопника клубненосного показало, что исследуемое средство не вызывает изменений иммунитета, выявляемых по влиянию на лимфоидные органы, в реакциях гиперчувствительности замедленного типа, антителообразования и фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов.