Изучение индивидуальной изменчивости растений Rhodiola rosea L. в целях отбора ценных генотипов для микроклонального размножения

гибель проростков в открытом грунте, что требует использования оранжерей для достижения растениями имматурного возрастного состояния. Реально это достигается через два года, после чего растения могут быть пересажены в открытый грунт на производственную плантацию. Весьма перспективным путем массового получения посадочного материала является использование метода микроклонального размножения растений [6]. Поскольку микроклональное размножение является одним из способов вегетативного размножения, можно ожидать, что получаемые при этом растения-регенеранты будут сохранять морфологические и биохимические признаки растений-доноров. В связи с необходимостью создания высокопродуктивных агроценозов представляется актуальным изучение индивидуальной изменчивости растений в природных популяциях на Северном и Приполярном Урале с целью отбора ценных генотипов растений, характеризующихся крупным габитусом, быстрым набором биомассы каудексальной части растений и высоким содержанием салид-розида и гликозидов коричного спирта.

Изучение внутривидовой изменчивости является необходимым этапом, составляющим ботанико-географические основы селекции растений [7]. Наиболее пластичные, жизнеспособные и продуктивные популяции являются и наиболее гетерогенными, т.е. отличаются высокими показателями изменчивости [8]. Для раскрытия генетического потенциала данного вида и для отбора наиболее перспективных образцов для мик-роклонального размножения необходимо оценить уровень внутрипопуляционного фенотипического разнообразия морфологических и биохимических признаков и их изменение в новых условиях.

Материал и методика. Популяционные исследования и сбор исходного материала R. rosea проводили в 1992-1995 гг., 2006-2012 гг. в местах ее естественного произрастания на Приполярном и Полярном Урале. Состояние це-нопопуляций обследовано с использованием методики наблюдений, адаптированной для редких видов растений [9]. Исходный материал R. rosea был отобран в экспедиционных выездах в растительных сообществах, формирующихся на скалах, в гольцовом поясе, на альпийских и субальпийских луговинах горно-тундрового пояса, в притеррасной и прирусловой зонах речных долин и на островах в горах Северного и Приполярного Урала. Опыты по интродукции R. rosea проводили на стационаре Института биологии Коми НЦ УрО РАН, расположенном в 10 км к югу от г. Сыктывкара в среднетаежной подзоне Республики Коми. Почва опытного участка дерново-глеевая, среднеокультуренная, суглинистого механического состава. В период с 1992 по 1998 гг. проведено сравнительное изучение популяционной изменчивости 28 образцов R. rosea различного географического происхождения. Отобраны образцы, имеющие высокие значения коэффициентов изменчивости большинства признаков, что свидетельствует о высоком уровне их генетической гетероген-ности. В 2006-2007 гг. проводили изучение изменчивости растений второго поколения (F 2 ). В 2006 г. заложена коллекция из 17 образцов различного экологического происхождения с Полярного и Приполярного Урала. В течение 2006-2008 гг. проводили фенологические наблю-дения, определение семенной продуктивности, энергии побегообразования, оценку внутрипопуляционной изменчивости. Амплитуду изменчивости признаков определяли по шкале уровней изменчивости С.А. Мамаева [10].

В данной статье приведены материалы морфологических параметров образцов R. rosea, собранных в различных экотопах на Приполярном Урале. Образец 1 – правый берег р. Бал-банью, задерненный бечевник; образец 2 – г. Малдынырд, ручей Безымянный, прирусловый; образец 3 – оз. Грубепенди-ты, скалы; образец 4 – оз. Грубепенди-ты, альпийская луговина; образцы первого поколения, выращенные из семян: образец 5 – ручей Иг-Шор, прирусловый; образец 6 – ручей Сергей-Шор, прирусловый; образец 7 – ручей Иг-Щор, притеррасный; обра-зец 8 – г. Хасаварка-Из, субальпийская луговина; образец 9 – р. Левый Парнукаю, притеррасный; образец 10 – р. Пачвож, альпийская луговина; образец 11 – Левый Парнукаю, альпийская луговина; образец 12 – р. Торговая, притеррасный; образец 13 – растения, высаженные резидами из Норвегии, образец 14 – растения второго поколения F2. Химический анализ биологически активных веществ (салидрозида и розавина) проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в лаборатории Pharmaplant (Германия).

Результаты исследований и их обсуждение. Rhodiola rosea (сем. Толстянковые – Crassulaceae) – редкий, арктовысокогорный вид с почти циркумполярным ареалом. Общее распространение: арктическое побережье Евразии, север Великобритании, Скандинавия, горы Центральной Европы, Малой и Средней Азии, Монголии, Китая, северные Японские острова, атлантическое и тихоокеанское побережье Северной Америки. Высотные границы распространения в горных районах в различных географических зонах варьируют от 900 до 4000 м над уровнем моря [12]. На европейском Северо-Востоке R. rosea представлена популяциями, локализованными в уральской и арктической (приморской) частях ареала вдоль побережья Ледовитого океана [13]. В условиях Арктики вид приурочен к морскому побережью [14]. На территории Урала вид является перигляциальным реликтом, а в Арктике проходит граница его ареала [15, 16]. В Республике Коми вид особенно часто встречается на Урале, где из гольцового и горно-тундрового поясов спускается по долинам рек (Кожим, Косью, Сыня, Щугор, Илыч, Унья, верховьям Печоры) в горно-лесной пояс и в лесную зону Предуралья [17]. На Приполярном Урале вид отмечен в растительных сообществах, формирующихся на скалах, в гольцовом поясе, на альпийских и субальпийских луговинах горно-тундрового пояса, в притеррасной и прирусловой зонах речных долин, на бечевниках и на островах [18].

Условия произрастания привели к образованию чрезвычайно разнообразных форм. В Европе вид представлен многочисленной серией рас и разновидностей. В пределах Арктики также наблюдается многообразие форм. причем ряд из них имеет хорошо очерченный ареал [19]. Большая полиморфность растения позволила выделить отдельные географические расы в ранг самостоятельных видов [20, 21]. Вместе с тем широкое варьирование различных морфологических признаков (например, длина цветоножек и цветоносов, интенсивность антоциановой окраски генеративных органов), скорее может быть результатом гибридизации растений и позволяет рассматривать разновидности лишь в ранге подвидов, а не как виды [19]. В природе полиморфизм проявляется, прежде всего, в габитусе растений: кустистости, высоте побегов, форме листьев, количестве цветков, мощности корневой системы. Однако на фоне значи-тельной морфологической изменчивости ряд биологических свойств R. rosea сохраняется и при перенесении в другие экологические условия [18, 22-24].

Изученные растения отличались по ряду признаков. Мы анализировали высоту побегов, количества генеративных и вегетативных побегов, количество листьев на побеге, размеры листа срединной формации (табл. 1). Количество побегов у растений естественных местообитаний колебалось в пределах от 1 до 154, максимального размера достигали особи, растущие в расселинах скал (обр. 3), у культивируемых особей количе- ство побегов составляло 3-80 шт., этот признак отличался высокой индивидуальной вариабельностью. В некоторых случаях коэффициент вариации превышал 100, а в среднем для популяции он составлял 30%. У растений, привезенных из Норвегии (№ 13), количество побегов было в 2-4 раза меньше, чем у растений уральского происхождения.

Таблица 1. Морфологическая изменчивость растений родиолы розовой различного географического происхождения

Примечание: в верхней строке приведены среднее значение и его ошибка, в нижней строке – коэффициент вариации (%)

Длина генеративных побегов значительно меняется в зависимости от экотопа произрастания и широтного положения ценопопуляций. Эти различия сохраняются при культивировании растений. Минимальные значения характерны для образцов растений из альпийского и прируслового экотопов (№ 5, 6 и 10, 11). У образцов из субальпийского и притеррасного экотопов отмечены максимальные значения длины генеративных побегов (№ 8, 9, 12). Самыми низкорослыми оказались растения из Норвегии. Признак высоты побегов был более стабильным, чем количество побегов, коэффициент вариации составил 20-

40%. При интродукции по числу генеративных побегов от общего числа побегов норвежские растения превышали уральские в 1,5 раза. Доля генеративных побегов у уральских особей составляла 5-56%, у норвежских – 60%.

В составе образца растений второго поколения (F2) (№ 14) отмечено 55% плодоносящих и 45% мужских особей. Мужские особи отличались от женских и обоеполых меньшей высотой генеративных побегов, большим побегообразованием и степенью генеративности (52% и 45% соответственно). Полиморфизм проявляется в габитусе растений: кустистости, высоте побегов, форме листьев, количестве цвет-ков, мощности корневой системы. Форма куста отдельной особи определяется положением в пространстве генеративных побегов. Мы отмечали для R. rosea прямостоячую, полуразвалистую, развалистую и стелющуюся формы куста [18]. Соотношение растений с различной формой куста специфично для каждого образца. В образцах из прируслового и альпийского экотопа (№ 5, 6, 10, 11) преобладают особи с развалистой и стелющейся формой куста, в образцах притеррасного и субальпийского (№ 7, 8, 9) - с прямостоячей и полураз-валистой. У растений второго поколения отмечено примерно одинаковое соотношение разных форм куста¸ причем у женских особей больше прямостоячих (64%), у мужских - полуразвали-стых и развалистых (80%).

У культивируемых растений отмечено разнообразие образцов по окраске листьев. Выявлены растения с сизовато-зеленой, сизой, зеленой и светло-зеленой окраской. Соотношение особей специфично для каждого образца. У особей из прируслового и альпийского экотопа преобладает сизая окраска, у особей притеррасного и субальпийского - сизовато-зеленая и светлозеленая. У растений второго поколения отмечены все варианты окраски. У всех норвежских растений листья сизые. Изменчивость окраски листьев, вероятно, связана с толщиной кутикулы. Листья растений арктического происхождения имели более толстую листовую пластинку. Утолщение листа происходило за счет увеличения толщины слоев верхнего и нижнего эпидермиса, увеличения размеров и, объема клеток мезофилла. Арктические растения имели более крупные клетки палисадной и губчатой ткани по сравнению с клетками растений уральского происхождения [25]. Различия в структуре листа растений разного происхождения сохраняются в первом поколении, и, вероятно, отражают приспособления растений к условиям в природных местообитаниях.

Сравнение всех обследованных образцов по размерам и форме листа срединной формации выявило их неоднородность (рис. 1). В составе образцов отмечены особи с мелкими, средними и крупными листьями. Линейные размеры листа у норвежских растений ниже по сравнению с уральскими. Самый устойчивый признак – индекс листа (соотношение длины и ширины). У всех образцов данный признак варьировал от 2,3 до 3,1. В составе образцов отмечена широкая индивидуальная изменчивость этого показателя. Это растения с округлыми, яйцевидными, удлиненно-яйцевидными и продолговатыми листь- ями. Исключение составляет норвежский образец, имеющий низкий коэффициент варьирования изученного признака.

У растений, выращенных в условиях питомника, выявлены две волны интенсивного роста, две генерации побегов. У первой генерации отрастание наблюдали после схода снега, у второй - после цветения и плодоношения побе-гов первой генерации. За вегетационный период уральские растения формировали две генерации побегов, растения из Норвегии - только одну. Сравнение размаха внутривидовой изменчивости морфологических признаков в образцах родиолы розовой различного происхождения и в репродукциях показало, что амплитуда изменчивости изученных признаков в репродукциях, отражающая степень их генетической гетерогенности, изменялась с порядком репродукции. Выявлено некоторое возрастание степени гетерогенности во второй репродукции по большинству признаков. Следует отметить, что наиболее крупные растения были найдены в популяциях на р. Торговая. Наблюдения за растениями, выращенными из семян R. rosea данной популяции, показали, что они сохраняют крупный габитус и при интродукции в условия среднетаежной зоны.

Для биохимического изучения были отобраны образцы R. rosea, произрастающие как в естественных местообитаниях, так и культивируемые растения. Сведения о содержании са-лидрозида и розавина в растениях R. rosea многочисленны и противоречивы. По данным ряда авторов [26, 27] салидрозид содержится как в подземных, так и в надземных органах R. rosea . Содержание салидрозида в сухой массе подземных органов дикорастущих растений варьирует от 0,5-1,0% [26], 0,63-0,97% [28], 0,2-1,5% [29], 0,8-1,5% [30], 0,35-1,20% [31]. У культивируемых растений в Подмосковье и Самарской области - 0,8% [32, 33]. Проведенные нами исследования показали, что содержание салидрозида и розавина в подземных органах как дикорастущих, так и культивируемых растений уральского происхождения оставалось на сравнительно высоком уровне (табл. 2).

Максимальное содержание биологически активных веществ содержат подземные органы образца № 12 (р. Торговая). Содержание салид-розида и розавина достигало максимальных значений в начале вегетации, незначительно снижалось в конце вегетационного периода. Дикорастущие растения накапливали меньше салидрози-да, чем культивируемые. Возможно, это связано со значительным увеличением массы культивируемых растений.

•Httieti H«

" I I i й

Рис. 1. Изменчивость листьев срединной формации культивируемых растений Rhodiola rosea L.

Таблица 2. Содержание салидрозида и розавина в подземных органах дикорастущих и культивируемых растений R. rosea, % масс.

Выводы: фенотипическая внутривидовая изменчивость, свойственная природной популяции родиолы розовой, сохранилась и при интродукции в течение двух поколений. При перенесении и длительном выращивании R. rosea в условиях культуры растения сохраняют приз-наки, характерные для природных популяций. Скорость онтогенетического развития в условиях культуры выше, чем в местах естественного произрастания. У культивируемых растений возрастают общие размеры, ускоряется рост подземных органов и изменяется их структура. Культивируемые растения значительно превосходили дикорастущие особи по биомассе, доля каудекса и корней составляла около 80% от массы целого растения. Изучение внутривидовой изменчивости морфологических признаков у образцов R. rosea различного происхождения выявило их значительный полиморфизм. Отобраны образцы растений для микроклонального размножения, резко отличающихся по морфологическим признакам и содержанию вторичных метаболитов. Наиболее перспективным по комплексу признаков является образец № 12, отобранный из популяций на р. Торговая (Приполярный Урал), который, кроме высокого содержания салидрозида и розавина, характеризуется и крупным габитусом.

Работа выполнена при поддержке ориентированных фундаментальных исследований (офи) УрО РАН 2-4-019-КНЦ «Биотехнология микроклонального размножения ценных генотипов родиолы розовой (Rhodiola rosea L.) и регуляция роста и биосинтеза биологически активных веществ в условиях in vitro и in vivo» и гранта Международной программы «Barents-Secretariat» на стадиях экспедиционного обследования популяций Rhodiola rosea на Приполярном Урале в 2006-2008 гг.