Изучение изолятов Phytophthora infestans Mont. de Bary в посадках картофеля

Одной из самых распространенных болезней картофеля является фитофтороз, вызываемый патоген- ным оомицетом вида Phytophthora infestans (Mont.) de Bary. Описано не менее 100 видов фитофторы, поражающих широкий круг видов растений [1]. Фитофтороз особенно сильно поражает растения семейства паслёновые (Solanaceae). Основные пути распространения патогена – с капельной влагой, ветром в виде спор, а также с зараженным семенным материалом. Популяция фитофторы гетерогенна и представлена расами, которые выделяют на основании взаимоотношений с конкретными генотипами растений хозяев, имеющими специфические гены устойчивости, и более 100 генотипов выявлены на основании изучения изменчивости молекулярно-генетическими методами во всем мире. Кроме того, имеется два типа спаривания [2]. Все это приводит к быстрой адаптации патогена к противодействию как естественного, так и антропогенного характера и появлению новых, более агрессивных и устойчивых рас. Большинство собственных генов устойчивости картофеля к фитофторе потеряло актуальность, что привело к необходимости введения генов диких родственников для обеспечения иммунности к патогену [3]

Кроме того, стоит признать, что Phytophthora infestans является чуть ли не единственным паразитом, урон от которого невозможно избежать в рамках органического земледелия, так как лечению эта болезнь практически не поддается, можно только задержать ее развитие или предотвратить ее появление. Поэтому особенно важно знать особенности патогенеза и расового состава фитофторы в каждом отдельно взятом регионе выращивания пасленовых [4].

Цель работы – изучение расового состава Phytophthora infestans локальной популяции на посадках картофеля ФГБНУ «ФНЦ агробиотехнологий Дальнего Востока им. А.К. Чайки», исследование фенотипических, физиологических и генетических особенностей выделенных рас.

Задачи:

• 1 .Сбор,изоляция и дифференциация рас патогена с помощью сортов с известной генотипической характеристикой в отношении фитофтороза (сорта дифференциаторы);

• 2.    Идентификация и культивирование чистых культур изолятов in vitro ;

• 3.    Исследование морфологических, физиологических, генетических признаков выделенных изолятов для доказательства их различного происхождения и принадлежности к расам.

Материал и методика

В эксперименте использовали сорта картофеля, имеющие в геноме известные R-гены: Ранняя Роза, Приекульский ранний, Камераз (R 1 ), Изола (R 4 ), Эпока (R 3 R 4 ), Анко, Вулкан, Сузанна (R 1 R 3 ), Красноуфимский (R 2 R 4 ), Жуковский ранний (R 3 ), Невский (R 1 R 2 ). Картофель высаживали в полевых условиях (с.Пуциловка, Приморский край). Для выявления возбудителя фитофтороза проводили сбор листьев с характерными краевыми некрозами [5].

Изоляция,введение в культуру, определение патогена

Листья закладывали во влажные камеры до появления мицелия, после чего производили пересев кусочком мицелия на клубень картофеля. Их помещали во влажную камеру на 4-5 дней при температуре 18…20°С. Через 4-5 дней с ломтиков клубней образовавшийся мицелий культивировали на среду Хелла, содержащую KH 2 PO 4 – 0,5 г, MgSO 4 – 0,25 г, FeSO 4 – 0,01 г, глюкоза – 25 г, аспарагин – 0,5 г, тиамин – 0,002 г, рибофлавин – 0,002 г. Порядковые номера изолятов соответствовали названию сорта картофеля и дифференцируемой им расы патогена с присвоением литеры Ph. Идентифицировали возбудителей фитофтороза с помощью микроскопического анализа посредством Levenhuk DT750 5,3 МПикс [6].

Получение культурального фильтрата и изучение фитотоксической активности

Изоляты Ph.infestans культивировали на жидкую питательную среду Хелла, в состоянии покоя при температуре 18…20°С в течение 30 дней. Затем отфильтровывали культуральную жидкость и автоклавировали при 120°С в течение 30 мин. После определяли фитотоксическую активность изолятов гриба Ph.infestans. Для этого предварительно продезинфицированные 96% этиловым спиртом семена томата сортов Новичок, Земляк, Пикадор, Красный великан; фасоли – Золотая Сакса, пшеницы – Приморская 239, ячменя – Приморский 98, райграса – Московский 74, вики (по 20 шт. для каждого варианта) замачивали в дистиллированной воде в течение 24 часов Чашки Петри с семенами закрывали и инкубировали в термостате при температуре 18…20°С в течение 5 суток. Через 5 дней проростки семян погружали в фильтрат культуральной жидкости изолятов гриба Ph. infestans и выдерживали в нем в течение 2 час. Затем проростки инкубировали при 18…20°С в темноте. Через 48 час измеряли длину корней проростков. Фитотоксическую активность культурального фильтрата (ФАКФ) рассчитывали по степени ингибирования роста корней, используя формулу:

ФАКФ (%) = 100 – (Дх/Дк х100), где Дх – средняя длина корней через 48 час в опыте; Дк – средняя длина корней проростков через 48 час в контрольном образце. Токсичными принято считать культуральные жидкости, вызывающие 30% снижения учитываемых показателей. Отрицательные значения ФАКФ означают стимуляцию роста корней [7].

Оценку всхожести семян в почве на фоне вторичных метаболитов исследуемых изолятов фитофторы проводили в условиях культуральной комнаты в сосудах объемом 5 л. На данный объем автоклавированной почвы (5 л) вносили 4 мл культурального фильтрата, перемешивали и высевали семена, после оценивали всхожесть в процентах. Полученный результат сравнивали с контролем для каждой культуры без внесения фильтрата. Полученные результаты обрабатывали статистически и сравнивали с помощью t-критерия Стьюдента. Различия между показателями считали достоверными при p≤0,05. В тексте данные представлены в виде среднего и стандартного отклонения (x±S x ) [8]. Графики визуализированы в программе Microsoft Office Excel 2007.

ISSR-анализ изолятов

ДНК выделяли солевым методом с дополнительным этапом депротеинизации смесью хлороформ/фенол (1/1) из мицелия, культивированного на картофельно-сахароз-ном агаре [9]. Для постановки реакции использовали готовую реакционную смесь БиоМастер HS-Taq ПЦР-Color (2x) (Биолабмикс) с добавлением MgCl 2 до конечной концентрации 1 mМ, ~ 50 нг геномной ДНК и 0,3 mM праймера состава – (GA)8C (Биосан) в конечном объеме 10 мкл [10]. Контроль загрязнения и неспецифической гибридизации праймеров осуществляли холостой пробой, содержащую полную реакционную смесь без добавления ДНК. Амплификацию проводили в термоциклере T100 (Биорад), используя температурный режим: 5 мин – 94°C, 35 циклов: 1 мин – 94°С, 1 мин – 55°С, 2 мин – 72°С; 7 мин – 72°С [11]. Амплификат фракционировали электрофорезом в 2% агарозном геле окрашенном бромистым этидием, фрагменты ДНК визуализировали в гельдокументи-рующей системе Geldoc XR+ (Биорад). Для оценки длин использовали маркер Step 50 plus (Биолабмикс). Полученные изображения фореграмм обрабатывали с помощью программы GelAnalyzer 19.1 [12]. Расчет генетических характеристик проводили с использованием пакетов программ TFPGA [13].

Результаты и обсуждение

Материал собирали в период эпифитотии, во время развития характерных симптомов в питомниках картофеля отдела картофелеводства и овощеводства ФГБНУ «ФНЦ агробиотехнологий Дальнего Востока им. А.К. Чайки». Отмечали поражение 80% посадок картофеля с повреждением органов растений. Микроскопическое исследование изолятов гриба показалo наличие мицелия и зооспор, характерных для фитофторы (рис. 1).

Культурально-морфологические признаки семи изоля-тов были типичными для Ph. infestans с вариациями формы колоний, характера и окраски мицелия, окраски реверса для разных изолятов:

Рис.1.Морфологические структуры изучаемых изолятов. а – спорангиеносец с зооспорангиями,

R 4 ;б – зооспорангии,Levenhuck D740T,x60, зеленый светофильтр (фото авторов)

Fig.1.Morphological structures ofthe studied isolates.

a – sporangiophore with zoosporangia,

R4;b – zoosporangia,Levenhuck D740T,x60, green lightfilter (photos ofthe authors)

R 1 Колонии белого цвета, хорошо заметные с неровными краями, концентрические. Мицелий прижатый коралловидный, белого цвета. Спороношение обильное.

R 3 Колонии беловатого цвет, хорошо заметные. Мицелий шерстистый, плотный, бесцветный.

R 4 Колонии серого цвета. Мицелий ватообразный, жесткий с массовым спороношением, серый. Реверс среды окрашен в малиновый до алого.

R 1 R 2 Колонии беловатого цвета, полупрозрачные, бархатистые с неровными краями. Мицелий прижатый.

R 1 R 3 Колонии прозрачно-белого цвета, хорошо заметные, с неровными краями. Мицелий прозрачный, прижатый

R 2 R 4 Колонии беловатого цвета, полупрозрачные, хорошо заметные, с неровными краями. Мицелий приподнимающийся, пушистый, тонкий, бесцветный.

R 3 R 4 Колонии белого цвета, войлочные, реверс белый, концентричность слабая.

Для выявления генетических различий и доказательства расовой принадлежности полученных культур был использован ISSR-анализ. На данном этапе исследования было решено использовать только простые расы, выделенные нами в результате выращивания сортов дифференциаторов – R 1 , R 3 и R 4 . В результате исследования с использованием праймера (GA)8C амплифицировано 33 фрагмента, 24 из которых оказались полиморфными, уровень полиморфизма составил 72,73% (рис.2).

Рис.2.Электрофореграмма продуктов амплификации используемого праймера.R1-R4 – исследуемые расы фитофторы,М – маркер длин фрагментов Step 50 plus,К – контроль реакции

Fig.2.Electropherogram ofthe amplification products ofthe primer used.R1-R4 - studied phytophthoraraces,M – markerof fragmentlengths,Step 50 plus, K – reaction control

На основании картины распределения фрагментов были рассчитаны индексы генетических различий (минимальные генетические дистанции Нея - D Nmin ) для исследуемых рас [14]. Наименьшие различия выявлены в паре R 1 /R 3 (0.2424), в то время как R 4 имеет наибольший уровень отличий как от R1 так и R 3 (0.6667 и 0.5455 соответственно) (табл. 1). Для визуализации выявленных различий построена UPGMA дендрограмма филогенетических взаимоотношений исследуемых образцов (Рис.3).

Таблица 1. Минимальные генетические дистанции

Нея простых рас фитофторы по данным ISSR-анализа Table 1. Minimum genetic distances of simple phytophthora races according to ISSR analysis

7            .525           .35           .175          0.000