Изучение эффективности применения комбинированного энтеросорбента на основе гидроксиапатита кальция при лечении эймериоза

Простейшие, поражающие желудочно-кишечный тракт (ЖКТ), вызывают кишечные инфекции, которые встречаются практически на всех континентах мира [1–3] с преимущественным распространением в странах с жарким климатом и представляют наибольшую опасность для детей и лиц с иммунодефицитом [4]. Наиболее распространены такие заболевания, как эймериоз, бласто-цистоз, балантидиаз, являющийся профессиональной болезнью работников свиноводческих ферм, так как естественным носителем Balantidium coli являются свиньи, криптоспоридиоз и др. Большинство протозойных кишечных инфекций имеют фекально-оральный путь передачи [5], но существуют и другие способы распространения протозойной инфекции, к ним относят респираторные формы кокцидиозов с воздушно-капельным путем передачи. Чаще заражение происходит при проглатывании с пищей и водой ооцист, выделяющихся с калом больных. В кишечнике человека из ооцист выходят спорозоиты, внедряются в эпителий, разрушают его, возникает воспаление, иногда образуются язвы.

Помимо того, что спорозоиты могут проникать в эпителиальные клетки кишечника хозяина и разрушать их, они также мигрируют в желчные ходы, в дальнейшем поражают печень, также возможно попадание спорозоитов в почечные канальцы, при этом миграции эймерий в кровь при заболевании не происходит. Появляются лихорадка с температурой до 39 °С, слабость, снижение аппетита, обезвоживание, нарушения пищеварения, диарея. Для лечения кокцидиозов применяют сульфаниламидные препараты, которые системно действуют на организм и могут вызывать аллергические реакции. Паразитирование данных простейших приводит к нарушению архитектоники ворсинок, из-за чего снижается всасывание питательных веществ.

При лечении кокцидиозов [6] применяют сорбенты (смекта, неосмектин и др.), содержащие в составе алюминий, который, по современным данным, может накапливаться в организме, что приводит к нарушению функций организма, дестабилизации структуры и количества хромосом, развитию болезни Альцгеймера и другим токсическим явлениям [7–10]. В связи с этим актуально проведение разработки более безопасного и эффективного энтеросорбента для лечения протозойных заболеваний.

Гидроксиапатит кальция (ГА), используемый в качестве действующего вещества при разработке энтеросорбента, является естественной составляющей костной ткани человека [11]. ГА широко применяется в медицине [11, 12], он используется в стоматологии для восстановления структуры эмали и наращивания костной ткани, в ортопедии и травматологии для замещения костной ткани и остеоиндукции, в косметологии и пластической хирургии как инъекционный филлер для контурной пластики. Кроме того, ГА обладает сорбционными свойствами, что и позволило использовать его как экспериментальный энтеросорбент.

Цель исследования: изучить эффективность применения комбинированного энтеросорбента на основе ГА и сравнить эффективность его использования с коллоидным диоксидом кремния (Полисорбом) в отношении простейших (эймерий) в эксперименте на кроликах.

Материал и методы

Для получения комбинированного энтеросорбента использовали ГА, изготовленный по патенту [13]. Гидроксиапатит кальция Ca10(PO4)6(OH)2 является основным неорганическим компонентом костной и зубной ткани человека и применяется во многих областях медицины [11], так как обладает реминерализирующими, остеогенными и сорбционными свойствами. ГА синтезированный по ТУ 9398001-00882879-2016, соответствует стандартам ГОСТ Р ИСО 10993 «Оценка биологического действия медицинских изделий», ГОСТ Р 51148-98 «Изделия медицинские. Требования к образцам и документации, представляемым на токсикологические, санитарно-химические испытания, испытания на стерильность и пирогенность», соответствуют протоколу токсикологических испытаний местнораздажающего действия и гемолитической активности медицинских изделий (материалов), устанавливающих их биологическую безопасность, № 616.016Р от 13 сентября 2016 г.

Получение кремнийзамещенного ГА проводили с молярным отношением Са /Р – 2,5, молярным отношением Са /( Р+Si ) – 1,67 и содержанием кремния около 5,8 мас.% (19 мас.% силикат-иона), по патенту [14]. Получен комбинированный препарат формулы:

Ca10(PO4)6-x(SiO4)x(OH)2-x, где 1 ≤ х ≤ 2.

Исследование эффективности применения разработанного препарата выполняли на кроликах, зараженных эймериозом [15]. Перед началом эксперимента у кроликов фиксировали клиническое состояние и вес. Для заражения кроликов поместили на подстилку, собранную из неблагополучного по эймериозу фермерского хозяйства. Эксперименты на животных проводили строго в соответствии с законодательной базой, Хельсинкской декларацией о гуманном отношении к животным, нормативными актами (Приказ Минздрава СССР «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных» № 755 от 12.08.1977 г.; Приказ Минздрава РФ «Об утверждении правил лабораторного практикума» № 266 от 19.06.2003 г.), с одобрения локального этического комитета ФГБОУ ВО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского» Минздрава России, протокол № 03 от 04.10.2022 г.

Эксперимент проводили в условиях вивария Саратовского ГАУ на базе «Факультета ветеринарной медицины пищевых и биотехнологий». Были смоделированы условия напольного содержания кроликов. Животные содержались группами в клетках по 10 особей на несменяемой подстилке. Для поения использовали чистую воду в соответствии с нормами СанПиН 2.1.4.1074-01. Поение осуществляли посредством ниппельных поилок. Кормление кроликов производили в соответствии с возрастными потребностями комбикормом производства ООО «РОСТок». Производитель отрицает использование ан-тикокцидийных препаратов в составе комбикорма. В помещении поддерживали микроклимат согласно нормам содержания лабораторных животных.

Для изучения эффективности применения комбинированного препарата ГА+Si при эймериозе был проведен эксперимент, в котором использовали 40 кроликов в возрасте 21 сут. Животных разделили на четыре группы, по 10 кроликов в группе, следующим образом: 1-я группа – здоровый контроль, заражение и терапию не проводили; 2-я группа – зараженный контроль, терапия не проводилась; 3-я группа – зараженная опытная группа, препарат для терапии – комбинированный энтеросорбент на основе ГА; 4-я группа – зараженная группа сравнения, препарат терапии – Полисорб («Полисорб МП» – кремния диоксид коллоидный, АО «Полисорб», Россия).

Начиная с 7-х сут после заражения, во 2, 3 и 4-й группах проводили лабораторное исследование помета на наличие ооцист через каждые 7 сут до выявления простейших. Ежедневно учитывали клиническое состояние кроликов. Обнаружение ооцист эймерий производили флотационным методом с определением видового состава эймерий. Интенсивность инвазии определяли количественным методом в 1 г фекалий с использованием камеры МакМастера или камеры Горяева, таким образом определяли OPG (oocysts per gram – ооцист в 1 г).

После лабораторного и клинического выявления заболевания на 21-й день после заражения в опытной группе применяли комбинированный препарат ГА в дозе 0,05 г на 1 кг массы тела животного, перорально с кормом, в течение 5 дней. Использование энтеросорбента на основе ГА в указанной дозировке обусловлено экспериментально установленным отсутствием эффективности применения препарата в дозе 0,025 г/кг/сут в отношении простейших (эймерий) у кроликов.

В группе сравнения применяли Полисорб в дозе 0,1– 0,2 г на 1 кг массы тела животного, перорально в смеси с кормом, в течение 5 дней.

Полученные результаты анализировали в системе MatLab R2018b при помощи пакета Statistics Toolbox. Для проверки нормальности распределения выборочных данных проводили тест Лиллиефорса. Количественные показатели описывали медианой и межквартильным интервалом Ме ( Q ₁; Q ₃). Категориальные показатели представлены относительными (в %) частотами встречаемости. В связи с тем, что полученные данные имели распределение, отличное от нормального, при дальнейшей статистической обработке уровень статистической значимости различий количественных показателей в группах оценивали с использованием непараметрического критерия Манна – Уитни. Для оценки статистической значимости межгрупповых различий относительных частот использовали критерий χ ². Пороговый уровень статистической значимости различий составлял p = 0,05.

Результаты и обсуждение

Начало выделения ооцист у животных было зарегистрировано на 8-е сут после заражения. В течение первой недели заболевания клинические симптомы не были выявлены. Со второй недели стали появляться клиниче- ские признаки в виде размягчения фекалий. На третьей неделе признаки достигли максимума, масса тела кроликов снижалась, наблюдали кровавую диарею с примесями слизи у некоторых особей. Нарастание клинических признаков заболевания сопровождалось ростом интенсивности инвазии.

Установили видовой состав эймерий [16], обнаруженных у зараженных кроликов: Eimeria (E.) perfringens , E. magna , E. media , E. coecicola, E. exiqua . При определении вида эймерий учитывали размеры ооцист, их форму, особенности строения (наличие или отсутствие микропиле). При этом индекс обилия Eimeria perfringens превосходил аналогичный показатель остальных видов (таблица).

Таблица. Видовой состав и морфологические особенности эймерий, обнаруженных у кроликов

Table. Species composition and morphological features of eimeria found in rabbits

Вид эймерий Type of Eimeria	Длина, мкм Length, µm	Ширина, мкм Width, µm	Индекс обилия, экз. Abundance index, ex.
E. perfringens	22,45 (19,50; 24,85)	19,44 (15,69; 23,17)	58 000
E. magna	30,40 (21,65; 32,05)	20,35 (12,40; 21,66)	22 000
E. media	34,81	21,09	5 600
	(29,90; 35,75)	(17,33; 27,84)
E. coecicola	36,31	21,90	2 300
	(27,58; 40,10)	(29,20; 31,23)
E. exiqua	22,23 (16,11; 25,59)	20,08 (18,66; 26,20)	2 500

После начала лечения интенсивность инвазии учитывали ежедневно. На 1-е сут терапии значимых различий в интенсивности инвазии ЖКТ кроликов контрольной, опытной и группы сравнения не наблюдалось. Со 2-х сут зарегистрировано плавное снижение интенсивности инвазии в группах, получающих терапию. При этом резкое снижение интенсивности инвазии более чем на 30% от значений 1-х сут терапии зарегистрировано в группе применения препарата ГА+Si на 3-и сут терапии. Количество выделяемых животными ооцист на 4-е сут терапии в группе применения ГА+Si снизилось на 46% по сравнению с группой контроля и на 26% – по сравнению с группой применения Полисорба. К 5-м сут в опытной группе и группе сравнения значения интенсивности инвазии достигли показателей ниже 20 000 OPG (рис. 1).

Установлено, что комбинированный препарат ГА обладает сорбционными свойствами, необходимыми для лечения протозойной инфекции ЖКТ (эймериоза) [17, 18]. При этом интенсэффективность комбинированного препарата ГА на 31% превосходит интенсэффектив-ность коллоидного диоксида кремния, что обеспечивает более выраженный терапевтический эффект при лечении эймериоза в сравнении с Полисорбом. Выявлено, что терапевтическая доза ГА+Si ниже дозы По-лисорба 0,05 г/кг и 0,1–0,2 г/кг соответственно. Интенс-эффективность коллоидного диоксида кремния равна 49% в сравнении с комбинированным препаратом ГА+Si (80%).

Hill

1                    2                    3                    4                    5

Сутки терапии Day of therapy ■ Г руппа контроля/control Group

• □    Экспериментальный препарат/Experimental drug

• □    Препарат Сравнения/Comparison drug

Рис. 1. Влияние комбинированного энтеросорбента на основе гидроксиапатита и энтеросорбента коллоидного диоксида кремния на интенсивность инвазии ооцист эймерий в желудочно-кишечном тракте кроликов

Примечание: */# – р < 0,05 различия между группой контроля и экспериментальной группой/группой сравнения, **– в группе контроля терапия не проводилась, в качестве экспериментального препарата использовали комбинированный препарат гидроксиапатита кальция, в качестве препарата сравнения применяли коллоидный диоксид кремния («Полисорб»).

Fig. 1. Effect of a combined enterosorbent based on hydroxyapatite and an enterosorbent of colloidal silicon dioxide on the intensity of invasion of oocysts of eimeria in the gastrointestinal tract of rabbits

Note: */# – p < 0.05 differences between the control group and the experimental/comparison group, ** – no therapy was carried out in the control group, a combined preparation of calcium hydroxyapatite was used as an experimental drug, colloidal silicon dioxide («Polysorb») was used as a comparison drug.

Известны исследования гидроксиапатита кальция, используемого для удаления билирубина [19] из крови свиней посредством экстракорпоральной гемоперфузии, в других исследованиях гранулы кремний-замещенного гидроксиапатита, имплантированного подкожно мышам, применяли для адсорбции инсулина, также исследовалась способность адсорбции токсинов, выделяемых различными патогенными штаммами микроорганизмов на гидроксиапатит. Проведенное нами исследование также подтвердило адсорбционную способность ГА, которая проявлялась в снижении интенсивности инвазии ЖКТ кроликов ооцистами простейших. Результаты проведенного эксперимента представляют возможность дальнейшего изучения ГА в качестве желудочно-кишечного адсорбента при лечении не только протозойных инфекций, но и отравлений различными экзогенными токсическими веществами, для перспективного применения энтеросорбента на основе ГА в клинической медицине.