Изучение комплекса грибов Armillaria mellea sensu lato в центральных районах Красноярского края

Раздорожная, Т. Ю. Изучение комплекса грибов Armillaria mellea sensu lato в центральных районах Красноярского края [Электронный ресурс] / Т. Ю. Раздорожная, Е. А. Шилкина // Лесохоз. информ. : Электрон. сетевой журн. – 2016. – № 1. – С. 48–59. URL:

В задачи исследования входило:

• 1.    Отобрать образцы грибов комплекса Armillaria mellea s. l. в разновозрастных хвойных древостоях на территории Красноярского и Еме-льяновского лесничеств Красноярского края, выделить чистые культуры.

• 2.    Изучить влияние температуры на рост мицелия выделенных штаммов опенка осеннего.

• 3.    Дать оценку агрессивности штаммов Armillaria mellea s. l. путем искусственного внедрения патогена в ткани растения.

• 4.    Провести видовую идентификацию штаммов, устойчивых к низким температурам и проявляющих агрессивные свойства в отношении растения-хозяина.

Решение указанных задач позволяет изучить особенности развития исследуемых грибов в условиях Красноярского края, облегчить диагностику возбудителей корневых гнилей, в том числе с использованием инновационных молекулярногенетических методов, и в дальнейшем дать рекомендации по сдерживанию их развития.

Объекты и методы исследований

Объекты исследования – грибы комплекса Armillaria mellea sensu lato, отобранные с усыхающих деревьев хвойных и лиственных пород на территории Красноярского и Емельяновского лесничеств Красноярского края. Детальное лесопатологическое обследование изучаемых территорий показывает, что корневые системы хвойных и лиственных пород всех категорий, включая внешне здоровые, в той или иной степени повреждены гнилями. Периферическая часть древесины разрушается по типу белой волокнистой коррозионно-деструктивной гнили, типичной для воздействия грибов рода Armillaria .

Для выделения чистых культур грибов с комлевой части и корней усыхающих деревьев отбирали образцы древесины размером 3–5 см, а также плодовые тела и культивировали их в чашках Петри на агаризированном сусло-агаре (1,5–2,0 %, 4о по Баллингу) в термостате при температуре 24–26 оС. Чистоту культур проверяли микроскопированием [4].

Исследование экологических особенностей представителей комплекса Armillaria mellea s.l. проводили на 5 штаммах, выделенных в процессе работы и отличающихся географической и субстратной приуроченностью (табл. 1).

Влияние температур на рост грибницы изоля-тов Armillaria mellea s. l. изучали методом агаровых блоков (d = 0,5 см) путем инкубирования в течение 4 недель в холодильной камере при температуре 6 и 24 ^оС. При этом еженедельно фотографировали и фиксировали интенсивность зарастания чашки Петри мицелием гриба с помощью лабораторно-программного комплекса по исследованию радиального прироста древесных растений [5].

Таблица 1. Характеристика использованных штаммов

Штамм	Растение-хозяин	Категория состояния деревьев	Район сбора образцов
1	Populus tremula L.	I	Красноярское лесничество
2	Pinus sylvestris L.	II	То же
3	Pinus sibirica Du Tour	I	Емельяновское лесничество
4	Pinus sylvestris L.	I	То же
5	Betula pendula Roth.	V	«-»

Патогенность (агрессивность) изолятов комплекса Armillaria mellea sensu lato изучали в питомнике путем инокуляции 2-летних саженцев сосны обыкновенной, лиственницы сибирской, ели обыкновенной, сосны кедровой сибирской (кедра сибирского) чистыми культурами патогена по модифицированной методике Соколова [6]. Модификация заключалась в том, что у отобранных саженцев с соблюдением асептики отрезали тонкий кусочек коры, мицелий патогена плотно прикладывали к камбию и прижимали корой. Для предотвращения высыхания и разрушения опенка почвенными грибами и бактериями кусочек коры закрепляли с помощью полиэтилена. Эксперимент проводили в конце мая – начале июня при среднесуточной температуре 2,7 ^оС и влажности воздуха 69 %. Для учета результатов по внедрению патогена в ткани растения осуществляли вскрытие сделанной прививки, микроскопирование древесины, а также дублирование выделения чистой культуры из пораженной древесины. Часть саженцев оставляли для учета степени усыхания от воздействия изучаемого гриба.

Видовую принадлежность изолятов Armillaria mellea sensu lato идентифицировали с помощью морфологического описания плодовых тел, а также методов «ди-мон» и секвенирования.

Макроскопические характеристики опенка осеннего фиксировали на стадии плодовых тел. Сбор и высушивание проводили согласно общепринятым методикам. Для микроскопирования частей сухих плодовых тел методом «раздавленная капля» использовали 5 %-й раствор КОН, 3–10 %-й аммиачный раствор конго красного. Значения количественных показателей базиро- вались на измерении не менее 20 спор и различных специфических структур (базидии, цистиды, пряжки и т.п.) [7].

Для видовой идентификации методом «димон» (дикарион-монокарион) использовали метод совместного культивирования, сращивая поочередно диплоидные изоляты рода Armillaria mellea s. l., инокулированные на агаровые блоки, и штаммы-тестеры нескольких интестерильных групп, любезно предоставленные в 2006 г. доктором Кари Корхоненом (Финляндия) [8]. К одной интерстерильной группе диплоидный изолят относили при явном изменении морфологии хотя бы одного из 5-ти тестеров на крустозный тип мицелия и отсутствии демаркационной линии на границе двух культур в течение 4-недельного культивирования [9].

Молекулярно-генетическую диагностику грибов проводили методом полимеразной цепной реакции с последующим секвенированием фрагментов [10]. Анализировали регион рДНК, включающий следующую последовательность локусов: 18S рРНК-ВТС1-5,8S-рРНК-ВТС2-28SрРНК [11]. Экстракцию ДНК проводили из свежей культуры гриба. Выделение ДНК осуществляли с помощью набора реагентов DiatomTM (ООО «Лаборатория Изоген»), согласно протоколу фирмы-производителя.

Для проведения полимеразной цепной реакции использовали набор реагентов GenPak PCA Core (ООО «Лаборатория Изоген») и универсальные праймеры ITS1 F (5-TCCGTAGGTGAACCT-GCGG-3) (10 мкм); ITS4 R (5-TCCTCCGCT-TATTGATATGC-3) (10 мкм). Процесс амплификации проводили в термоциклере по следующей программе:

• 1)    денатурация t = 4 мин, T = 96 ^оС;

• 2)    денатурация t = 1 мин, T = 96 ^оС;

• 3)    отжиг t = 30 сек, T = 55 ^оС;

• 4)    элонгация t = 2 мин, T = 72 ^оС; со 2-го по 4-й шаг, 30 циклов;

• 5)    элонгация t = 10 мин, T = 72 ^оС;

• 6)    охлаждение реакционной смеси t = 5 мин, T = 4 ^оС.

Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК осуществляли в агарозном геле (2 %). Загрузочный раствор каждой дорожки состоял из 5 мкл образца ДНК и 2 мкл загрузочного буфера (30 %-й глицерин, 0,5 %-й бромфеноловый синий). Электрофорез проводили при комнатной температуре в течение 2 ч при параметрах тока 90 V/60 мА. Детекция продуктов электрофореза достигалась окрашиванием гелевых пластин в растворе бромистого этидия. Для визуального наблюдения гель помещали в УФ-трансиллюминатор. Фотодокументирование продуктов электрофореза достигалось за счет видеосканирования в УФ-свете специальной системой GelImager.

Для видовой идентификации патогенов осуществлялось иссечение фрагмента геля, содержащего ДНК-фрагмент гриба. Очистку фрагментов ДНК от геля выполняли в соответствии с протоколом набора реагентов Clean up mini (Евроген). Секвенирование фрагментов ДНК проводили с помощью генетического анализатора ABI PRISM 310 (Applied Biosystems) по методике, предложенной фирмой-производителем. Интерактивный анализ нуклеотидных последовательностей образцов осуществляли с помощью программы Sequencing Analysis v.6 и Variant Reporter v.2, CLC DNA Workbench v. 6. Результаты секвенирования в формате FASTA использовали для идентификации с помощью баз данных NCBI и Mycobank.

Результаты и обсуждение

Согласно литературным данным, оптимальными температурами для роста мицелия опенка являются 19–25 оС [6, 12]. При температуре ниже 11 оС их рост очень слабый, а ниже 5 оС и выше 35 оС – полностью прекращается. Северные европейские виды A. borealis, A. cepistipes, A. ostoy-ae имеют более низкий температурный оптимум, чем южные (из низких широт) виды A. gallica и A. mellea [8].

Исследование влияния температуры на рост грибницы выделенных корневых патогенов выявило наличие особых свойств сибирских штаммов. Образцы, отобранные с деревьев I–II класса Крафта, по скорости формирования грибницы в оптимальных температурных условиях относились к группе быстрорастущих штаммов, но при температуре 6 оС имели низкую способность формирования мицелия. В то же время были отмечены изоляты, имеющие среднюю скорость роста при оптимальных условиях, а также проявившие себя быстрорастущими при низкой температуре, например, штаммы 3, 4, 5 (рис. 1). Это свидетельствует о высокой устойчивости сибирских видов опенка к низким температурам, что согласуется с данными И. Н. Павлова и др. [13, 14].

Такая устойчивость для патогенов комплекса Armillaria mellea sensu lato играет положительную роль, так как их развитие начинается при более низких температурах и завершается позднее, чем у других дереворазрушающих грибов. Это позволяет грибнице не только достичь камбиального слоя, но и привести дерево к гибели, успешно закрепиться, создав защитные структуры, а также позволяя опенку осеннему успешно перезимовать.

Искусственному заражению подверглись саженцы 5-ти хвойных пород (по 10 шт.). Активное внедрение патогена в здоровое растение наблюдалось только для штамма 4 в отношении сосны кедровой сибирской и сосны обыкновенной (табл. 2, рис. 2). Штаммы 1, 2, 3 и 5 не проявили агрессивных свойств в отношении заражаемых растений-хозяев: у инфицированных участков растений отсутствовали признаки поражения, штаммы искусственно внедренных фитопатогенов из тканей саженцев не выделялись.

В результате проведенных исследований штамм 4 A rmillaria mellea s. l. был отобран для дальнейшей видовой идентификации по трем направлениям: морфологическое описание, ме-

б

Рис. 1. Рост мицелия Armillaria mellea sensu lato при различных температурах (на примере штамма 4): а – при температуре 24 ^оС (1 неделя эксперимента);

б – при температуре 6 оС (1 неделя эксперимента);

в – при температуре 24 оС (4 неделя эксперимента);

г – при температуре 6 оС (4 неделя эксперимента)

г

Таблица 2. Результаты искусственного заражения хвойных растений штаммами Armillaria mellea sensu lato, шт.

Растение-хозяин	Штаммы Armillaria mellea sensu lato
	1	2	3	4	5
Лиственница сибирская	0/10	0/10	0/10	0/10	0/10
Сосна обыкновенная	0/10	0/10	0/10	2/10	0/10
Сосна кедровая сибирская	0/10	0/10	0/10	5/10	0/10
Ель обыкновенная	0/10	0/10	0/10	0/10	0/10

тод скрещивания культур с тестерами и молекулярно-генетическая идентификация.

Морфологическое описание плодовых тел штамма 4 Armillaria mellea sensu lato (рис.

• 3). Шляпка полукругло-выпуклая до распростертой, поверхность темно-кремовая, бледноохристая. Чешуйки темно-коричневые, лохматые, торчащие вверх, состоящие из нескольких

пучков, густо расположенные в центральной части, более редкие по краям. Поверхность шляпки точечно-крапчатая, иногда местами голая. Край шляпки белесый с остатками частного покрывала без чешуек, ровный. Пластинки светло-кремовые, почти белые; коротко низбе-гающие, частые с пластиночками. Край пластинок ровный. Пластинки светлыми линиями продолжаются до кольца. Кольцо двойное, пушисто-войлочное. Имеется белая ложбинка между верхней и нижней частью кольца. Верхняя часть беловойлочная. Нижняя часть кольца обычно окрашена в желтоватый и желтый цвет и покрыта многочисленными бурыми, отдельно расположенными точечными чешуйками. Ножка того же цвета, что и пластинки. К основанию имеет буроватый оттенок, само основание темно-бурое. Вся поверхность ножки покрыта клочками частного покрывала с бородавками. Плодовые тела растут пучками на корневых лапах сосны обыкновенной. Микроскопирование: базидии булавовидные длиной 45 мкм и диаметром 8–10 мкм, септированные, основание с пряжками. Это подтверждает, что данное плодовое тело не относится к группе A. mel-lea . Имеются 2–4 стеригмы высотой 5 мкм и более. Споры крупные, размером 12 x 8 мкм, от овальных до миндалевидных.

Согласно полученному описанию данный штамм предположительно относится к виду Armillaria borealis [15].

Тест-скрещивание проводили со следующими видами: A. mellea, A. ostoyae, A. gallica, A. borealis, A. cepistipes . Данный метод, основанный на сексуальной совместимости грибов, показал, что штамм 4 относится к виду Armillaria borealis (рис. 4). Согласно литературным данным [9, 12], указанный вид не характеризуется агрессивными свойствами и не играет весомой роли в ослаблении древостоев на территории Европы и Америки, однако его способность вызывать в Сибири массовые очаги усыхания хвойных пород представляет большой научный и практический интерес.

Молекулярно-генетические исследования подтвердили ранее полученные нами данные о

Рис. 2. Стволик 2-летнего саженца сосны кедровой сибирской, искусственно инфицированный штаммом 4 Armillaria mellea sensu lato: в месте заражения наблюдается некроз тканей

аб

Рис. 3. Морфологическое описание опенка осеннего: а – плодовые тела Armillaria borealis, б – базидия с 4-мя стеригмами, пряжкой и спорой

видовой принадлежности исследуемого штамма. Сравнение полученного сиквенса с генетической базой данных позволило достоверно определить его вид как Armillaria borealis (AJ250052.1). Полученные данные свидетельствуют о том, что трудоемкие и длительные по времени классические методы видовой идентификации могут быть успешно заменены на генетические, как более быстрые, но не менее надежные.

а

Рис. 4. Тест-скрещивание A. borealis с тестерами: а – положительная реакция;

б – отрицательная реакция

б

Выводы

• 1.    Большинство штаммов фитопатогенных грибов комплекса Armillaria mellea s. l., отобранных в ослабленных древостоях на территории центральной части Красноярского края, характеризуются способностью к активному формированию грибницы и защитных структур при низких температурах окружающей среды. Эта особен-

• ность сибирских штаммов Armillaria mellea s. l. может служить причиной усиления их патогенных свойств, приводящих к массовому куртинному усыханию хвойных лесов в Красноярском крае. Целесообразно расширить ареал исследований в данном направлении на территории Сибири.

• 2.    В результате видовой идентификации наиболее агрессивный и патогенный из выде-

• На наш взгляд, изучение проблемы корневых патогенов, представленных комплексом Armillaria mellea s.l., имеет большое прикладное значение. В настоящее время вредоносность указанного комплекса недооценена, в том числе по причине наличия множества противоречивых данных о его видовом составе. Учитывая, что комплекс включает ряд агрессивных видов, таких как A. ostoyae и A. borealis, а идентификация

их систематической принадлежности традиционными методами весьма затруднительна из-за отсутствия определителей для сибирских видов, возникает потребность в расширении арсенала используемых методов, например, с помощью молекулярно-генетической диагностики. Это позволит провести детальные исследования особенностей видового состава комплекса Armillaria mellea s. l. с целью написания новых ключей для определителей сибирских штаммов и создания базы данных по их пространственной распространенности. Наличие такой базы будет способствовать осуществлению более качественного мониторинга корневых гнилей в древостоях хвойных и лиственных пород.