Изучение особенностей распространенности вируса папилломы человека и его физического статуса при немелкоклеточном раке легкого

Известно, что в этиологии рака легкого (РЛ) определенную роль играет множество факторов, начиная от курения и неблагоприятных экологических условий, заканчивая различными индивидуальными молекулярно-генетическими параметрами организма. Установлено, что возможной причиной развития РЛ могут являться полиморфизмы генов, регулирующих метаболизм канцерогенных веществ, клеточный цикл и другие ключевые процессы канцерогенеза и т. д. [1, 2]. При РЛ наблюдается гиперметилирование промоторов различных генов, связанных с важными функциями, включая контроль пролиферации, апоптоз, клеточную адгезию, репарацию ДНК [3, 4]. Вирусная этиология РЛ практически не рассмотрена, также не установлено влияние вирусов на течение данного злокачественного новообразования. В немногочисленных работах особое внимание уделяется вирусу папилломы человека (ВПЧ), который является важным этиологическим и прогностическим фактором не только при различной гинекологической патологии [5], но и при опухолях других локализаций, в частности верхних дыхательных путей и пищеварительного тракта [6].

Некоторые авторы описывают случаи 100 % спонтанной трансформации папиллом в дифференцированную плоскоклеточную карциному легких (51,1 %) и гортани (42,9 %) [7]. Ранее у данных пациентов в папилломах был выявлен ВПЧ низкого канцерогенного риска (НКР) – 6 и 11 типы. Согласно данным метаанализа, частота встречаемости вируса при РЛ колеблется в широких пределах в зависимости от количества обследованных пациентов: от полного отсутствия вируса в опухолевой ткани до 75 % и более [8, 9]. В подавляющем большинстве случаев при РЛ встречаются ВПЧ высокого канцерогенного риска (ВКР) – 16 и 18 типы, которые, по данным мировой литературы, чаще всего выявляются у больных раком шейки матки [10].

Таким образом, несмотря на наличие работ, посвященных изучению связи ВПЧ и РЛ, опубликованные на сегодняшний день литературные данные в силу противоречивости результатов не

Таблица 1/Table 1

Клинико-патологические параметры больных

Clinical and pathological parameters of the studied patients

Клинико-патологический параметр/Clinical and pathological parameter           ^{Кол-во бол} _p ^ь _a ^н _ti ^ы _en ^х _ts ⁽ⁿ _(n ⁼ ₌ ³ ₃ ⁰ ₀ ^)/ ₎ ^{Number of}

Возраст, лет/Age,years 58,8 ± 1,2 Т1 3 (10 %) Размер опухоли/Tumor size Т2 3 (10 %) Т3 24 (80 %) Т4 - N0 7 (23,3 %) Лимфогенное метастазирование/ N1 13 (43,3 %) Lymph node metastasis N2 N3 10 (33,4 %) - Стадия/Stage IIB IIIA 10 (33,4 %) 20 (66,6 %) Плоскоклеточный рак/ 17 (56,7 %) Гистотип/Histological type Squamous cell carcinoma Аденокарцинома/Adenocarcinoma 13 (43,3 %) Операции/Surgery Пневмонэктомия/Pneumonectomy 9 (30 %) Лобэктомия/Lobectomy 21 (70 %) дают убедительных доказательств участия ВПЧ в патогенезе рака легкого. В России изучения роли данного вируса в канцерогенезе РЛ не проводилось, что определяет актуальность и перспективность подобного научного исследования.

Целью исследования является определение наличия ВПЧ-инфекции высокого канцерогенного риска у больных немелкоклеточным раком легкого.

Материал и методы

В настоящее исследование включено 30 больных первично-операбельным немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ) IIBIIIA стадии (табл. 1), центральной и периферической локализации, проходивших обследование и лечение в НИИ онкологии Томского НИМЦ. Диагноз верифицирован гистологически, пациентам проводилась операция в объеме пневмонэктомии или лобэктомии. Адъювантная химиотерапия назначалась по показаниям в зависимости от результатов исследования операционного материала. Исследование проходило в соответствии с Хельсинкской декларацией 1964 г. (исправленной в 2013 г.) и с разрешения локального этического комитета института.

В качестве исследуемого материала были использованы операционные образцы нормальной и опухолевой ткани легкого (~60–70 мм3) и цельная кровь каждого пациента. Образцы ткани помещали в раствор RNAlater (Ambion, USA). После 24-часовой инкубации при +4 ºС образцы опухоли сохраняли при температуре –80 ºС для дальнейшего выделения ДНК.

ДНК из полученных образцов выделяли при помощи набора QIAamp DNA mini Kit (Qiagen,

Germany) в соответствии с инструкцией производителя. Концентрация ДНК измерялась при помощи флуориметра Qubit 4.0 (Thermo Fisher Scientific, USA) с использованием набора для количественной оценки ДНК. Концентрация составила от 10 до 100 нг/мкл. Выделенная ДНК хранилась при –80 ºС в низкотемпературном морозильнике (Sanyo, Japan) и использовалась для дальнейших микроматричных исследований.

Выявление и генотипирование ДНК ВПЧ проводили методом ПЦР в режиме реального времени на приборе RotorGene 6000 (Corbett Research, Australia) с использованием комплектов реагентов фирмы «Amplisens®» («АмплиСенс® ВПЧ ВКР скрин-титр-FL», кат# R-V31-T4x (RG,iQ,Mx); «АмплиСенс® ВПЧ ВКР генотипFL», кат# R-V25(RG,iQ,Mx) (Москва, Россия). Определяли наличие ВПЧ 16 и 18 генотипов. Значение вирусной нагрузки рассчитывалось в геномных эквивалентах ДНК ВПЧ/105 клеток, порог релевантного количества вируса принимался равным 3 lg ДНК ВПЧ/105 клеток в соскобе. Метод основан на одновременной амплификации (мультиплекс-ПЦР) и детекции в режиме «реального времени» участков ДНК Е1-Е2 генов ВПЧ и участка ДНК бета-глобинового гена, используемого в качестве эндогенного внутреннего контроля. Выявление области Е6 при отсутствии области E1/Е2 интерпретировалось как интеграция ВПЧ в ДНК человека, выявление области Е6 при наличии области E1/Е2 – как смешанная форма/ частичная интеграция вируса в ДНК человека, отсутствие области Е6 при наличии области E1/ Е2 – как эписомальная форма вируса.

Оценку отдаленной выживаемости проводили по методу Каплан – Майера.

Таблица 2/Table 2

Результат определения наличия ВПЧ ВКР и вирусной нагрузки

The result of determining the presence of HpV HVL and viral load

Пациент/ Patient	Стадия/Stage	Определение типа ВПЧ/Вирусная нагрузка/Determination of the type of HPV/viral load
		Нормальная ткань легкого/ Normal lung tissue	Опухолевая ткань/ Tumor tissue	Кровь/ Blood
К1	IIB		16/малозначимая/ 16/insignificant	16/малозначимая/ 16/insignificant
Л1	IIIA	16/малозначимая/ 16/insignificant	16/значимая/ 16/significant
С1	IIIA	33/малозначимая/ 33/insignificant	33/малозначимая/ 33/insignificant

Проведенная работа отвечает этическим стандартам, разработанным в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2000 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. № 266. От лиц, участвовавших в исследовании, получено информированное согласие.

Результаты исследования

В результате исследования была оценена частота встречаемости ВПЧ в исследуемых образцах на каждого пациента. ВПЧ был обнаружен у 3 (10,0 %) и не выявлен у 27 больных (90,0 %). У ВПЧ-негативных пациентов были проведены повторная процедура выделения ДНК и идентификация ВПЧ в исследуемых образцах. В результате было подтверждено отсутствие ВПЧ у данных пациентов.

В зависимости от инфицированности ВПЧ пациенты были разделены на 2 группы наблюдения: ВПЧ-позитивные (n=3) и ВПЧ-негативные (n=27). В таблице 2 представлены полученные данные по определению ВПЧ ВКР для вирус-позитивных пациентов с РЛ. Показано, что для каждого из ВПЧ-позитивных больных наличие вируса идентифицировано в 2 из 3 исследуемых образцов на пациента. Для 100 % вирус-позитивных больных ВПЧ ВКР определен в опухолевой ткани легкого, для больных Л1 и С1 также ВПЧ определен в нормальной ткани легкого, для больного К1 – в крови. Наличие ВПЧ в нормальной ткани легкого или в крови может свидетельствовать о разных путях проникновения вируса в легкие – пероральном в первом случае и через кровь – во втором.

После генотипирования ВПЧ было определено, что у пациента К1 идентифицирован ВПЧ 16 типа в опухолевой ткани и крови, у пациента Л1 16 генотип вируса определен в нормальной и опухолевой ткани легкого, у 3-го пациента (С1) вирус также определен в нормальной и опухолевой ткани легкого, но выявлен 33 генотип. Далее в положительных образцах была определена вирусная нагрузка. Ви- русная нагрузка менее 105 геномных эквивалентов (ГЭ) ВПЧ ВКР в соскобе или 103 ГЭ, приходящихся на 105 клеток человека, считается клинически малозначимой, а количество вируса более 105 ГЭ, приходящихся на 105 клеток, обозначается как повышенная нагрузка. В нашем исследовании было показано, что в подавляющем большинстве случаев определена клинически малозначимая вирусная нагрузка в ВПЧ+ образцах, полученных от пациентов с РЛ. Необходимо отметить, что единственным образцом с клинически значимой вирусной нагрузкой оказалась опухолевая ткань пациента Л1 (табл. 2).

Далее была оценена степень интеграции вируса у ВПЧ16-позитивных больных РЛ. Так, было показано, что в опухолевой ткани пациента К1 выявлена смешанная форма вируса, тогда как в крови этого пациента вирус находился в эписомальной форме. При этом в опухолевой ткани пациента Л1 выявлена интегрированная форма вируса, тогда как в нормальной ткани вирус присутствовал в смешанной форме.

Последним этапом работы была оценка без-метастатической выживаемости больных РЛ в зависимости от инфицированности ВПЧ ВКР. Было обнаружено, что у ВПЧ-позитивных пациентов наблюдается 100 % 5-летняя безметастатическая выживаемость, тогда как у ВПЧ-отрицательных пациентов этот показатель составил 63 % (рис. 1). Различия статистически не значимы из-за малочисленности первой группы (log-rank test, p=0,28). Несмотря на малочисленность выборки, полученные данные о благоприятном исходе у больных раком легкого при наличии ВПЧ являются очень интересными и требуют дальнейшие исследования.

Обсуждение

В результате проведенного исследования установлено, что частота встречаемости ВПЧ ВКР в опухолевой ткани у больных немелкоклеточным раком легкого на примере выборки Томского региона составляет 10,0 %, а частота встречаемости ВПЧ ВКР в нормальной ткани легкого этих же пациентов составляет 6,7 %. При этом, согласно данным метаанализа 2015 г., наличие ВПЧ-инфекции в ткани легкого связано с риском развития рака

Рис. 1. Безметастатическая выживаемость ВПЧ-позитивных и ВПЧ-отрицательных больных раком легкого (log-rank test, p=0,28)

Fig. 1. Non-metastatic survival of HPV-positive and HPV-negative patients with lung cancer (log-rank test, p=0.28)

легкого (OR=5,67, 95 % CI: 3,09–10,40, p<0,001). В опухолевой и нормальной ткани распространенность ВПЧ 16 типа составила 19,8 % и 3,37 % соответственно. Аналогичный результат получен при анализе ВПЧ 18 типа – 18,59 % в опухолевой ткани и 5,24 % в нормальной [11]. Полученные данные согласуются с результатами проведенного ранее собственного метаанализа, согласно которому частота встречаемости ВПЧ в опухолевой ткани при РЛ составила 28,7 %, при частоте встречаемости ВПЧ в нормальной ткани легкого – 7,6 % [8].

Интересные данные были получены при определении типов ВПЧ ВКР в настоящей работе. Классическим лидером по частоте встречаемости признан ВПЧ 16 генотипа (66,7 % случаев), что также согласуется с данными литературы, в которых именно ВПЧ определен как агент высокого канцерогенного риска при опухолях различных локализаций [12, 13]. Важно отметить, что также был определен и ВПЧ 33 генотипа. Полученные в исследовании факты важны в эпидемиологическом плане, поскольку в литературе опубликованы данные по особенностям распространения ВПЧ ВКР при раке шейки матки в Томской области, согласно которым в регионе 2-е и 3-е место занимает ВПЧ типов 33 и 31 – 11,9 и 10,4 % соответственно. Однако для подтверждения особенностей циркулирования ВПЧ ВКР при немелкоклеточном раке легкого в Томской области требуется увеличение выборки больных и дальнейшие эпидемиологические исследования.

При анализе 100 образцов опухолевой ткани легкого установлено, что частота ВПЧ-позитивных больных РЛ составляет 19 %, причем распределение генотипов ВПЧ было следующим: ВПЧ 16 – 8 (42,1 %); ВПЧ 11 – 3 (15,8 %); ВПЧ 6 – 1 (5,2 %); ВПЧ 59 – 1 (5,2 %); ВПЧ 33 – 2 (10,5 %); ВПЧ 31 – 2 (10,5 %), ВПЧ 18 – 2 (10,5 %) случая [14].

Поскольку сам факт инфицирования ВПЧ даже высокого онкогенного риска не позволяет в полной мере судить о вероятности возникновения рака, необходимо учитывать и другие показатели ВПЧ-инфекции, которые коррелируют с тяжестью патологического процесса и позволяют оценивать риск злокачественной трансформации у каждого пациента. Одним из таких показателей онкоген-ности вируса является вирусная нагрузка. Согласно данным исследований значения вирусной нагрузки в качестве предиктора развития РЛ, как правило, выявляется очень низкая вирусная нагрузка: менее одной копии вируса на клетку в исследуемых образцах [15]. Это подтверждается другими исследованиями, в которых выявлена очень низкая вирусная нагрузка в опухолевой ткани легкого – 0,02 [16] и 0,003 [17]. Данное явление может быть обусловлено так называемым механизмом «Hit-and-run», когда происходит интеграция вируса в клетку с последующей элиминацией вирусного генома. Некоторые авторы считают, что даже низкая вирусная нагрузка (1–2 копии на клетку) достаточна для запуска канцерогенеза в ткани легкого [18]. В настоящее время не найдены публикации, освещающие вопрос исследования физического статуса ВПЧ в ткани опухоли легкого. Результат этой части исследования сложно интерпретировать в силу малочисленности выборки, однако впервые полученные данные о физическом статусе ВПЧ 16 типа при РЛ фактически указывают на возможность и необходимость определения данного вирусологического критерия даже при малой концентрации ДНК ВПЧ.

Вопрос о связи между ВПЧ-инфекцией при РЛ и выживаемостью до сих пор остается неопределенным, в первую очередь это связано с малым количеством исследований по данной тематике. Тем не менее имеющиеся в литературе данные согласуются с результатами настоящего исследования. Так, J.L. Wang et al. показали, что больные с ВПЧ 16 и 18 типов в аденокарциноме легких имеют более высокие показатели выживаемости по сравнению с пациентами без наличия вируса в опухоли [19]. C. Ragin et al. также показали, что наличие вируса в опухолевой ткани у пациентов с РЛ сопряжено с хорошим прогнозом заболевания [20]. Хороший исход при наличии ВПЧ-инфекции также отмечается и при других локализациях злокачественных новообразований: раке гортани и ротоглотки [21], раке шейки матки [10] и колоректальном раке [13].