Изучение первых стадий сборки вириона у Х-вируса картофеля

Вирионы ХВК представляют собой гибкие нитевидные образования длиной 515 нм и диаметром 13,5 нм со спиральной структурой. Около 1300 идентичных субъединиц белка оболочки (БО) формируют полярную спираль с шагом 3,6 нм. Вирусная РНК заключена между витками этой спирали, на каждый виток приходится 8-9 субъединиц БО (1).

ХВК — первый нитевидный вирус растений, реконструированный in vitro из РНК и БО (2). Различия в структуре нативных вирионов и та- ких реконструированных частиц (вирусоподобные частицы или вирусные рибонуклеопротеиды, соответственно ВПЧ или вРНП), не обнаружены. Кроме того, выявлено, что БО ХВК не способен к полимеризации в отсутствие РНК (3), но может формировать in vitro вРНП не только с РНК ХВК, но и с гетерологичными нуклеиновыми кислотами (2). Позже при изучении структуры и свойств таких вРНП (ВПЧ) было показано, что они гомологичны нативным вирионам (4, 5).

K.H. Kim и C. Hemenway (6) предположили, что 5'-район РНК ХВК участвует в координации образования вирусной частицы. До сих пор участок инициации сборки ХВК полностью не охарактеризован, хотя в ряде работ подтверждено, что он находится на 5'-конце молекулы РНК (7-9). Недавно были опубликованы данные, продемонстрировавшие, что кэп-структура на 5'-конце молекулы РНК играет ключевую роль при образовании вРНП ХВК, влияя на конформацию 5'-концевого участка молекулы РНК и способствуя его узнаванию БО ХВК при инициации сборки частиц (10).

Цель представляемой работы заключалась в изучении первых стадий сборки вириона у Х-вируса картофеля (ХВК) на примере вирусоподобных частиц, полученных при инкубации РНК и белка оболочки ХВК в разных условиях.

Методика. Вирионы ХВК (штамм Русский) выделяли из листьев растения Datura stramonium , как описано ранее (11), белок оболочки ХВК — после обработки вирусной суспензии раствором LiCl (12), РНК — фенольным методом (13).

Для получения ВПЧ РНК и БО ХВК инкубировали при молярном соотношении 1:700 в течение 10 мин при комнатной температуре в буфере Трис-HCl (0,01-0,001 М) при рН 7,5; 8,0 и 8,5. При обработке ВПЧ микрококковой нуклеазой (МН) («Fermentas», Литва) фермент активировали в присутствии CaCl2 (100 мМ), добавляли к ВПЧ, оставляли на 10 мин при комнатной температуре, после чего реакцию останавливали этиленгликольтетрацетатом (EGTA, 250 мМ). После обработки МН фрагменты РНК выделяли с использованием тРНК в качестве соосадителя.

Обратную транскрипцию и полимеразную цепную реакцию (ОТ-ПЦР) проводили согласно протоколу производителя («Promega», США). Использовали прямой и обратный праймеры, комплементарные последовательностям фрагментов геномной РНК ХВК — соответственно 21-40-й нуклеотиды (нт) и 950-981-й нт.

Анализ нуклеиновых кислот, а также РНК в составе ВПЧ (метод торможения в геле) осуществляли с помощью электрофореза в 1 % агарозном геле, приготовленном на буфере ТАЕ (Трис-ацетат — 40 мМ, ЭПТА — 2 мМ, pH 8,0; 0,025 мкг бромистого этидия). В лунки наносилась смесь РНК и БО, проинкубированных в различных условиях, в электрофорезном буфере, содержащем 10 % глицерин и бромфеноловый синий в концентрации 0,2 %. Электрофорез проводили в горизонтальной электрофоретической системе QS-710 («IBI Scientific», США) при постоянном напряжении 70 В. После завершения электрофореза гель фотографировали под ультрафиолетовым светом ( X = 254 нм) с помощью системы хемилюминисцент-ной детекции ChemDOC XRS+ («Bio-Rad», США).

Для исследования ВПЧ методом просвечивающей электронной микроскопии образцы контрастировали 2 % раствором уранилацетата (микроскоп JEOL JEM-1011, «JEOL Ltd.», Япония; ускоряющее напряжение 80 кВ). Изображение получали с помощью цифровой камеры (ES500W, Erlangshen, «Gatan», США), применяя программное обеспечение DigitalMicrograph («Gatan», США). Статистические данные о длине и диаметре

ВПЧ получали на основе анализа микрофотографий с использованием программы для обработки изображений ImageJ (National Institutes of Health — Национальный институт здоровья, США).

Нуклеотидные последовательности анализировали с применением данных и инструментария The mfold Web Server (14).

Результаты. Для изучения первых стадий сборки вирионов ХВК РНК ХВК инкубировали с БО при молярном соотношении 1:700 в различных условиях. В вирусной частице молярное соотношение РНК:белок составляет 1:1300 (1). Использованное нами количество БО недостаточно для инкапсидации всей РНК, и в результате образуются частицы, у которых часть молекулы РНК в составе ВПЧ остается свободной. Такие ВПЧ (single tailed particles — STP, частицы с одним хвостом) с 3'-концом РНК, свободным от БО, и палочковидными головками, сформированными в результате спиральной упаковки БО на 5'-концевом фрагменте РНК, были описаны ранее (9). Вероятно, STP служат одной из транспортных форм вируса наряду с вирионами ХВК (9). Следует отметить, что даже при молярном соотношении РНК:БО, соответствующем таковому в вирионе, большая часть реконструированных препаратов вирусных частиц содержала неполные (не достроенные до нормальной длины) частицы (3).

1     2     3      4     5      6      7

Рис. 1. Электрофореграммы вирусоподобных частиц, полученных in vitro в результате сборки из РНК и белка оболочки (БО) Х-вируса картофеля (ХВК) при разной величине ионной силы и рН буфера : 1 — контроль (свободная РНК ХВК), 2, 4, 6 — 0,01 М Трис-HCl (соответственно рН 7,5; 8,0 и 8,5), 3, 5, 7 — 0,001 М Трис-HCl (соответственно рН 7,5; 8,0 и 8,5). Молярное соотношение РНК и БО — 1:700; 1 % агарозный гель, окрашивание бромистым этидием.

Из представленных электрофореграмм (рис. 1) видно, что при сборке ВПЧ интенсивность окрашивания полосы, соответствующей геномной РНК ХВК (см. рис. 1, дорожка 1), уменьшалась и появлялись продукты, обладающие меньшей подвижностью в геле вследствие образования частиц, у которых РНК в разной степени упакована в БО (см. рис. 1, дорожки 2-7). Полосы с наибольшей молекулярной массой соответствовали ВПЧ, в которых основная часть РНК упакована в белок. При увеличении рН от 7,5 до 8,5 в 0,01 М Трис-HCl буфере эффективность сборки заметно повышалась, то есть увеличивался набор продуктов с большей молекулярной массой (см. рис. 1, дорожки 2, 4, 6). В инкубационном буфере 0,001 М Трис-HCl набор продуктов практически не менялся с изменением рН (см. рис. 1, дорожки 3, 5, 7), но при рН 8,5 интенсивность полосы с самой высокой молекулярной массой оказалась максимальной (см. рис. 1, дорожка 7). Таким образом, РНК ХВК в указанных условиях эффективно связывалась с БО, формируя ВПЧ, в которых большая часть геномной РНК была упакована в спиральную оболочку. Важно отметить следующий факт: хотя интенсивность полос, соответствующих образовавшимся ВПЧ разной длины, менялась в зависимости от условий инкубации, положение этих полос при электрофорезе в 1 % агарозном геле оставалось неизменным. Создавалось впечатление, что при сборке БО с РНК ХВК в направлении 5'^3' на определенных участках молекулы нуклеиновой кислоты возникают стоп-сигналы, преодоление которых становилось возможным при изменении ионной силы и pH инкубационного буфера.

При изучении морфологии ВПЧ, полученных в условиях эффективной сборки (0,001 М буфер Трис-HCl, pH 8,5), с использованием просвечивающей электронной микроскопии (рис. 2, Б) было показано, что ВПЧ представляют собой частицы разной длины, идентичные по диаметру и структуре вирионам ХВК (см. рис. 2, А). ВПЧ оказались короче, чем вирионы ХВК, то есть часть молекулы геномной РНК в составе ВПЧ не связана с БО.

А

Б

Рис. 2. Электронные микрофотографии нативных вирионов Х-вируса картофеля (ХВК) (А) , вирусоподобных частиц (ВПЧ) , полученных in vitro в результате сборки из РНК и белка оболочки ХВК (Б) , и гистограмма распределения ВПЧ по длине (В) (просвечивающая электронная микроскопия, микроскоп JEOL JEM-1011, «JEOL Ltd.», Япония; ускоряющее напряжение 80 кВ; контрастирование 2 % раствором уранилацетата).

На гистограмме можно выделить 8 дискретных пиков, которые соответствуют частицам с длиной 60, 90, 160, 220, 300, 360, 420 и

460 нм (см. рис. 2, В). Эти данные согласуются с результатом анализа методом торможения в геле (см. рис. 1, дорожка 7), который показал, что полу ченные ВПЧ представляли собой дискретный набор частиц, гетерогенных по размеру. С учетом того, что у ХВК в вирион длиной 515 нм упакована РНК размером 6435 нт, ВПЧ указанной длины могут содержать фрагменты РНК размером соответственно 800, 1100, 2000, 2700, 3700, 4500, 5200 и 5700 нт.

Для того чтобы охарактеризовать участки геномной РНК, находящиеся в составе ВПЧ, частицы обрабатывали МН в условиях, когда РНК, связанная с БО в составе ВПЧ, защищена от воздействия нуклеазы. При электрофоретическом разделении полученных после этого образцов РНК был выявлен набор фрагментов размером от 800 до 5700 нт (рис. 3, А, дорожка 1). С целью выяснения, являются ли полученные фрагменты 5'-концевыми, каждый из них выделили индивидуально (см. рис. 3, А, дорожки 2-9) и использовали в качестве матрицы в реакции обратной транскрипции (ОТ) с последующей полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Для ОТ использовали олигодезоксирибонуклеотид, комплементарный области 950-981-го нт РНК ХВК. Для амплификации 5'-концевого района РНК ХВК методом ПЦР использовали прямой и обратный праймеры, соответствующие участкам 21-40-й и 950-981-й нт РНК ХВК. Ожидаемый продукт амплификации (см. рис. 3, Б)

был получен на основе большинства фрагментов (см. рис. 3, дорожки 2-8). Исключение составил фрагмент РНК, длина которого согласно маркерам меньше 876 нт (см. рис. 3, А, дорожка 9), то есть у него отсутствует область связывания с обратным праймером, соответствующим области 950-981-го нт РНК ХВК. Таким образом, в составе ВПЧ РНК представлена 5'-концевыми фрагментами генома ХВК. Это подтверждает, что инициация сборки вириона происходит на 5'-конце молекулы РНК и продолжается кооперативно в направлении от 5'- к 3' -концу молекулы.

Рис. 3. Анализ фрагментов РНК X-вируса картофеля (ХВК) , выделенных из реконструированных in vitro вирусоподобных частиц (ВПЧ) разной длины после обработки последних микрококковой нуклеазой: А — электрофоретическое разделение, Б — ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) соответствующих индивидуальных фрагментов РНК; 1 — набор фрагментов РНК, выделенный из ВПЧ (А), 2-9 — индивидуальные фрагменты РНК, 10 — тРНК, использованная в качестве со-осадителя (А); М — маркеры молекулярной массы ДНК (Б). Стрелками отмечены маркеры длины РНК, нт (А) и ДНК, п.н. (Б). Электрофорез в 1 % агарозном геле, окрашивание бромистым этидием. При ОТ-ПЦР использовали прямой и обратный праймеры, комплементарные последовательностям нуклеотидов РНК ХВК в положении соответственно 21-40 и 950-981.

Ранее S.J. Kwon с со-авт. (7), используя метод SE-LEX, выделили ряд последовательностей РНК, имеющих наибольшее сродство с Б О ХВК. При компьютерном мо делировании было показано, что полученные последовательности способны образовывать идентичные по структуре шпильки. Мы предположили, что аналогичные шпильки могут располагаться вдоль всей последовательности геномной РНК ХВК и влиять на взаимодействие БО с РНК.

Компьютерный анализ вторичной структуры нуклеотидной последовательности РНК ХВК в районах, соответствующих 3'-концам индивидуальных фрагментов РНК, выделенных из ВПЧ разной длины, выявил возможность формирования подобных РНК-шпилек. На рисунке 4 представлены шпилечные структуры, которые могут присутствовать на 3'-конце индивидуальных фрагментов (см. рис. 3) 1100, 2700, 5200 и 5700 нт, рассчитанной на основании гистограммы распределения ВПЧ по длине (см. рис. 2, В). Вероятность образования таких РНК-шпилек была показана и для индивидуальных фрагментов другой длины (800, 2000, 3700 и 4500 нт, данные не представлены).

Можно предположить, что обнаруженные нами шпильки выполняют роль «стоп-сигналов», препятствующих кооперативной сборке ВПЧ. Ранее сообщалось, что БО потексвирусов обладает способностью плавить вторичную структуру РНК (15). Для преодоления стоп-сигналов БО должен задержаться на таком участке РНК, расплавить шпильку, и только после этого будет продолжен процесс сборки вириона.

Рис. 4. Схематическое изображение предполагаемой вторичной структуры на 3'-концевых участках фрагментов РНК X-вируса картофеля, выделенных из вирусоподобных частиц разной длины: а — 1078-1117 нт, б — 2705-2757 нт, в — 5125-5183 нт, г — 5730-5792 нт. Градации серого цвета отражают силу взаимодействия между нуклеотидами. Изображения получены с помощью The mfold Web Server .

Итак, показано, что при инкубации РНК Х-вируса картофеля (ХВК) с белком оболочки (БО) ХВК в различных условиях (ионная сила, рН) образуется один и тот же набор вирусоподобных частиц (ВПЧ) дискретного размера. Однако количество таких ВПЧ меняется в зависимости от условий инкубации. Максимально эффективной сборки (ВПЧ приближались по размерам к нативному вириону) удалось достигнуть в буфере с низкой ионной силой при рН 8,5. Из ВПЧ выделены участки РНК, защищенные белковой спиралью. Показано, что все они — 5'-концевые фрагменты геномной РНК, имеющие разную длину. Получены дополнительные доказательства того, что сборка вирионов ХВК инициируется на 5'-конце РНК и кооперативно продолжается по направлению от 5'- к 3'-концу молекулы. При анализе нуклеотидной последовательности фрагментов РНК, выделенных из ВПЧ в районах, соответствующих 3'-концу молекулы, обнаружены участки, где возможно формирование РНК-шпилек, которые могут играть роль стоп-сигналов, препятствующих непрерывной кооперативной сборке ВПЧ. Вероятно, изменение условий инкубации влияет на способность БО плавить и преодолевать РНК-шпильки.