Изучение полиморфизма эстеразного состава зрелых семян образцов редиса (Raphanus sativus L.) коллекции ВИР

Редис – представитель семейства Brassicaceae, является широко       распространенной       овощной сельскохозяйственной культурой как на территории Республики Молдова, так и на территории Российской Федерации. Повышение продуктивности редиса и улучшение его хозяйственно ценных характеристик может быть достигнуто за счет использования современных генетикоселекционных технологий, в том числе молекулярногенетических и биохимических маркеров, позволяющих ускорять селекционный процесс [1]. Молекулярногенетические и биохимические маркеры являются важным инструментом в работе селекционера, они облегчают и ускоряют процесс создания новых сортов, обладающих необходимыми хозяйственно значимыми свойствами и признаками. Одними из наиболее широко используемых биохимических генетических маркеров являются изоферменты [2].

Изоферменты – это различные молекулярные вариации (формы) одного и того же фермента, выполняющие одну и ту же функцию [2, 3]. В растениях большинство ферментов, как правило, представлено несколькими изоферментными формами, часто со специфической внутриклеточной локализацией [4, 5]. Поскольку изоферменты – это с точки зрения структуры особая группа белков, то их можно дифференцировать электрофорезом. Данные электрофоретического анализа у растений часто используют для того, чтобы получить информацию о генетическом разнообразии, существующем в популяции и о степени дивергентности среди индивидуумов [4, 6]. Анализ полиморфного электрофоретического спектра изоферментных маркеров – это быстрый и относительно дешевый подход, который успешно применяется для экспресс-оценки генетических ресурсов растений [7, 8].

Основной задачей настоящей работы было проведение изоферментного анализа эстераз зрелых семян 25 образцов редиса из генетической коллекции ВИР с целью последующего выделения и подбора возможных родительских форм и/или исходного селекционно-значимого материала, предназначенных для использования в селекционных программах, направленных на повышение продуктивности у данной сельскохозяйственной культуры.

Материалы и методы

Материалом исследования служили зрелые семена 25 образцов редиса (Raphanus sativus L.) из коллекции ВИР (г. Санкт-Петербург) (табл. 1). Изучаемые образцы представляют пять разновидностей культуры.

Семена образцов тщательно размалывали в фарфоровой ступке, взвешивали в пробирках типа «Эппендорф» по 100 мг, добавляли 1 мл гексана и оставляли для обезжиривания на ночь в холодильнике. Затем пробы центрифугировали 10 минут при 16 тыс. об./мин. и температуре 15°С, сливали надосадочную жидкость и оставляли пробы под тягой для высушивания на воздухе.

В дальнейшем обезжиренный и высушенный растительный материал использовали для экстракции ферментов 0.01 М трис-НСl буфером при рН 8.3 в присутствие 2-меркаптоэтанола (2 мкл/мл), ЭДТА (0.5 мМ). Соотношение мука : буфер составляло 1:4, экстракцию ферментов проводили при температуре 4…8°С, продолжительность – 14-18 час. Образцы центрифугировали 10 мин, отбирали

	Таблица 1. Генотипы редиса из коллекции ВИРа
№         № каталога ВИР	Название образца             Происхождение               Разновидность
1                      187	Saxa                           Германия                      rubescens Sinsk.
2                   1233	Дунганский                         Китай                         roseus Sazon.
3                  1566	Ранний шарлаховый круглый                США                       rubescens Sinsk.
4                  1615	Червъни с объем опашка                 Болгария                        striatus Sinsk.
5                  1667	Красный великан                      Россия                         roseus Sazon.
6                   1762	Ohlsens Enke Halflong                      Дания                           striatus Sinsk.
7                   1855	Amager                           Финляндия                         striatus Sinsk.
8                   1939	French Breakfast                         Пакистан                           striatus Sinsk.
9                  2188	Candela di ghiaccio                       Италия                          subalbus Sinsk.
10                  2196	Местный                          Ливан                        rubescens Sinsk.
11                   2197	De Pontvil                             Франция                            striatus Sinsk.
12                  2210	Саратовский                        Россия                       rubescens Sinsk.
13                   2231	Vates' long scarlet                       Эфиопия                        rubescens Sinsk.
14                 2245	Местный                          Аргентина                         striatus Sinsk.
15                  2294	Promptus                          Германия                         striatus Sinsk.
16                 2302	Long ronge arabi                         Ливия                          rubescens Sinsk .
17                   2311	Largo rojo punta Blanca                      Испания                            striatus Sinsk.
18                 2313	Datil encarnalo                           Испания                            striatus Sinsk.
19                   2341	Largo rojo de mallorca                     Испания                         rubescens Sinsk.
20                  2347	Syla                               Дания                          subalbus Sinsk.
21                  2360	Helios                                Чехия                               chloris Alef.
22                   2371	Safir                                 Дания                             striatus Sinsk.
23                  2375	Rund Lalbrot Lalbweiss                       Дания                             striatus Sinsk.
24                 2379	Местный                          Ливан                         subalbus Sinsk.
25                  2380	Rund rosen rod Vitspetsig H.G.                 Швеция                          striatus Sinsk.
научно-практический	журнал           [ 4 ]              овощи россии № 5 (38)201 7

Рисунок 1. Электрофоретические профили изоформ эстераз у изученных генотипов редиса (№№1-25). Вдоль треков проставлены номера присутствующих в образце эстеразных зон, цифры справа – маркеры молекулярных масс (15-130 кД).

надосадочную жидкость и замораживали пробы при -20°С для длительного хранения и предотвращения инактивации изоферментов. Перед внесением в электрофоретическую камеру образцы размораживали при комнатной температуре.

Изоферменты разделяли методом нативного вертикального электрофореза в ПААГ, как описано в литературе [9]. Концентрация разделяющего и концентрирующего гелей была 11% и 5%, соответственно. Электрофорез осуществляли в камере Мini-PROTEAN Tetra Cell («Bio-Rad Laboratories, Inc.», USA). В качестве маркеров молекулярных масс использовали Prestained Protein Ladder («Thermo Scientific», USA). В каждый карман концентрирующего геля вносили по 15 мкг белка. Предварительно концентрацию белка в ферментных препаратах определяли методом связывания красителя по Bradford, в качестве стандарта при этом использовали БСА [10]. Электрофорез проводили на холоде (10…15°С), при 10 В/см в течение 2,5 час. По окончании электрофореза гель обрабатывали реактивом на неспецифическую эстеразу [11]. Для этого гель выдерживали в красителе до появления коричневато-фиолетовых полос, затем избыток красителя отмывали 10% уксусной кислотой.

Полученные зимограммы сканировали на сканере Epson Expression 10000XL («GE Healthcare», USA). Оценку каждого образца (значение Rf всех полос в треке, расчет молекулярных масс по стандартам) проводили с использованием программы Phoretix 1D Advansed («TotalLab, Ltd.», Great Britain).

Расчет степени наблюдаемой гетерозиготности H проводили как для каждого локуса, так и в среднем по нескольким локусам (общая гетерозиготность). Гетерозиготность популяции в каждом локусе H l и общую гетерозиготность Hобщ рассчитывали по следующей формуле [12, 13]:

где l – порядковый номер локуса, n – размер популяции, x_k – оцениваемая частота k -го аллеля l -го локуса, r – общее число локусов. Также вычисляли дисперсии гетерозиготности Var(H l ) по одному локусу и дисперсию средней гетерозиготности внутри популяции Var(H_общ) [14]:

Уаг(Но6щ) = ^Xz W - Я,) + ^Xz Li^H„ - HtHO

Результаты

В исследованных семенах 25 образцов редиса было выявлено 8 изоформ эстеразных ферментов с молекулярными массами, варьирующими от 37.7 кД до 57.6 кД (рис.1).

По наличию или отсутствию отдельных зон эстеразного состава все образцы были подразделены на 13 электрофоретических зимотипов (Гр. 1 – Гр. 13) (табл. 2).

Таблица 2. Распределение эстеразных зон среди зимотипов редиса

Зимотип      Зона 1 57.6 кД	Зона 2 54.8 кД	Зона 3 51 кД	Зона 4 48.4 кД	Зона 5      Зона 6 45.5 кД      43.7 кД	Зона 7 39.7 кД		Зона 8 37.7 кД		Общее число зон
Гр.1              +	+	++				+	+		6
Гр.2             +	+	+	++			+	+		7
Гр.3		++				+	+		4
Гр.4            +	+		+			+	+		5
Гр.5             +	+	+	+	++		+	+		8
Гр.6            +	+		+	++		+	+		7
Гр.7			+	++		+	+		5
Гр.8            +	+	+	+	+		+	+		7
Гр.9             +		+	+	+		+	+		6
Гр.10            +	+		+	+		+	+		6
Гр.11		+	+	+		+	+		5
Гр.12			+	+		+	+		4
Гр.13            +	+		+	+		+	+		6
Всего           9	8	5	9	8              11		13	13		76\76
Частота        11.84 зоны(%)	10.53	6.58	11.84	10.53          14.47	17.11		17.11
Зимотип Гр. 5 характеризовался наибольшим количеством зон, в его состав включены все 8 эстераз. Наименьшим количеством зон (по 4 шт.) обладали 2 зимотипа – Гр. 3 и Гр. 12. По 6 зон было обнаружено в				Таблица 3. Зимотипы редиса и их эстеразный состав
				Зимотип    Зоны эстераз*		Номера генотипов	**	Всего генотипов		%
четырех зимотипах – Эстеразный состав Гр.	Гр. 1, Гр. 9, Гр. 10 2, Гр. 6 и Гр. 8 включал		и Гр.13. в себя по	Гр.1             1, 2, 5, 6, 7, 8		9, 13, 15, 18, 19, 20			6	24
7 зон, пятью зонами зимотипов – Гр. 4, Гр. 7	был представлен состав трех и Гр.11.			Гр.2          1, 2, 3, 5, 6, 7, 8		16, 17, 23			3	12
Зона 7 (Mr = 39.7 кД) и зона 8 обнаружены в каждом зимотипе мономорфными.		(Mr = 37.7 кД) были т р пим аппаштг^а		Гр.3              5, 6, 7, 8		8, 24, 25			3	12
		,..		Гр.4             1, 2, 6, 7, 8		3, 4, 12			3	12
Остальные 6 зон были полиморфными и встречались среди зимотипов с частотой от 6.58% до 14.47%.				Гр.5         1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8		7, 21			2	8
Наиболее редко встречалась зона 3, она была обнаружена только в 5 зимотипах из 13 (6.58%). Наиболее				Гр.6          1, 2, 4, 5, 6, 7, 8				14
часто среди полиморфных встречалась зона 6, она была найдена в 11 зимотипах, процент встречаемости этой зоны составил 14.47%. Зона 1 и зона 4 встречались в 9 зимотипах и их частота встречаемости достигла 11.84%. Генотипы, имеющие сходный эстеразный состав и				Гр.7             4, 5, 6, 7, 8		14		14
				Гр.8          1, 2, 3, 4, 6, 7, 8		6		14
				Гр.9           1, 3, 4, 6, 7, 8		10		14
образующие один из зимотипов, представлены в таблице 3. Наиболее часто встречающийся зимотип - Гр. 1 -				Гр.10           1, 2, 4, 6, 7, 8		11		14
составил 24% от всех образцов, наиболее редкими зимотипами (4%) оказались Гр. 6 – Гр. 13, они были				Гр.11            3, 4, 6, 7, 8		22		14
представлены одним генотипом каждый. Три зимотипа (Гр. 2, Гр. 3 и Гр. 4) встречались одинаково часто – 12 % от общего количества. Гр. 5 характеризовалась частотой встречаемости - 8%. Зоны с высоким значением молекулярной массы (57.6 кД- 48.4кД): зоны 1– 4 - имели низкую интенсивность				Гр.12            4, 5, 7, 8		1		14
				Гр.13           1, 2, 4, 5, 7, 8		2		14
				* - зоны эстераз даны в соответствии с таблицей 2; ** - номера генотипов даны в соответствии с таблицей 1

Б

А

Рисунок 2. Образцы редиса сорта Amager (А) и сорта Helios (Б).

практически во всех образцах (рис.1). Зоны 5, 6, 7 и 8 (с меньшей молекулярной массой Мr = 45.5-37.7кД), наоборот, характеризовались высокой интенсивностью. Таким образом, у редиса наиболее значимыми в биохимическом плане являются зоны эстераз с меньшей молекулярной массой.

Полученные результаты позволяют выделить в качестве потенциальных родительских форм два образца (№7 и №21), входящих в зимотип Гр. 5. Они обладают уникальным изоферментным составом, представленным всеми восемью эстеразами. Причем интенсивность зон с низким Мr (зоны 4-8) в этих образцах довольно значительная. Данные образцы представляют ценность не только по биохимическим показателям, но и по важным морфологическим и хозяйственным признакам (рис. 2). Образец №7 – Amager (к-1855, Финляндия) представляет собой сорт-популяцию типа Французский завтрак, состоящую из нескольких близких биотипов. Вегетационный период 22-27 суток. Образец характеризуется способностью формировать компактную розетку с приподнятым расположением листа в условиях защищенного грунта при недостаточной освещенности (менее 5000 Лк), при этом средняя масса корнеплода составляет 8,3 г (урожайность 2,8 кг/м2). В условиях открытого грунта урожайность может достигать 6,5 кг/м2. Недостатком данного образца является быстрая потеря сочности корнеплода с образованием пустот.

Образец №21 – Helios (к-2360, Чехия) сортотипа Круглый желтый отличается очень высокой однородностью; вегетационный период его 25-30 суток. Образец среднеустойчив к недостаточной освещенности (всходы вытягиваются), но в тоже время отличается высокой товарностью урожая как в защищенном грунте, так и в открытом. Розетка полураскидистая, прямостоячая невысокая, опушение листа слабое, мягкое. Корнеплод крупный (до 21,0 г), округлый, темножелтого цвета со слабой шероховатостью, мякоть корнеплода плотная, острого вкуса, долго не теряющая сочность. Урожайность достигает 5,2 кг/м2.

Также представляет значительный интерес зимотип Гр.1. Представители этой весьма обширной группы (6 генотипов) включают в свой состав 6 эстеразных зон, из которых 4 зоны с низкой молекулярной массой представлены в значительном количестве.

Образцы, представленные в зимотипе Гр.1, относятся к трем разновидностям: var. subalbus Sinsk., var. rubescens Sinsk., var. striatus Sinsk. При этом пять высоко однородных образцов имеют удлиненную форму корнеплода, а образец №15 представляет собой сорт-популяцию, включающую несколько различающихся биотипов.

По данным изоферментного анализа был проведен расчет гетерозиготности популяции в каждом локусе H l и общей гетерозиготность Hобщ, а также дисперсии гетерозиготности Var(H l ) по одному локусу и дисперсию средней гетерозиготности внутри популяции Var(H_общ). Полученные результаты представлены в таблице 4.

Поскольку дисперсия средней гетерозиготности должна учитывать ковариации между гетерозиготностями по разным локусам, I и / , что обусловлено их зависимостью от частоты двойных гетерозигот НИ по этим локусам, то для расчетов этих

Таблица 4. Расчет гетерозиготности и дисперсии у образцов редиса по результатам изоферментного анализа

Эстеразные зоны 1 2345678 Гетерозиготность Hl    0,653 0,491    0,916    0,858    0,491    0,157      0        0       Гетерозиготность средняя Hобщ 0,446 Дисперсия Var(Hl)       0,009 0,01     0,003    0,005     0,01     0,005       0         0               Дисперсия Var(H) 0,001 величин была использована формула предложенная Б. Вейр [14]. Следует отметить, что использованные нами формулы [12-14] позволяют рассчитать любой многочлен в наборе переменных, распределенных мультиноминально, что, в свою очередь, позволяет рассматривать выявляемую гетерозиготность как меру информационного полиморфизма, широко используемого при составлении и реализации генетикоселекционных программ. В то же время, как известно, проявление любых генетико-селекционных свойств зависит от генотипа образцов и, следовательно, информационный полиморфизм есть ни что иное как реализация на фенотипическом и(или) биохимическом уровнях активности и распределения в геноме генов или локусов хромосом, отвечающих за проявление изучаемых признаков.

Таким образом, наличие восьми изоформ делает эстеразы зрелых семян редиса удобным биохимическим маркером, что может быть использовано при проведении как физиолого-биохимических, так и генетикоселекционных исследований.

• • Литература

  • 1.    Tyagi I.D., Variability and correlation studies in bottle gourd (Lagenaria siceraria). // Indian J. Hort. - 1972. - Vol. 29. - #2. - P. 219-222.

  • 2.    Чесноков Ю.В. Молекулярно-генетические маркеры и их использование в предселекционных исследованиях. СПб: АФИ, 2013. - 116 с.

  • 3.    Markert C.L., Moller F. Multiple forms of enzymes; tissue, ontogenic and species patterns. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1959. - Vol. 45. - P. 753-763.

  • 4.    Tanksley, S.D., Orton T.J., (eds) Isozymes in Plant Genetics and Breeding. North-Holland Publ. Co. Amsterdam. 1983.

  • 5.    Harris H. Enzyme polymorphism in man. // Proc. Roy. Soc. (London) -1966. - Vol. 164. - P. 298-310.

  • 6.    Bailey D.C., Isozymic variations and plant breeder rights. In: S.D. Tanksley and T.J. Orton (eds). Isozymes in plant genetics and breeding, Part A, Elsevier, Amsterdam. -1983. - P. 425-440.

  • 7.    Shaw S.R. Isozymes: classification, frequency, and significance // Int. Rev. Cytol. - 1969. -Vol. 25. - P. 297-332.

  • 8.    Brown A.H., Clegg M.T., Isozyme assessment of plant genetic resources // Isozymes Curr. Top. Biol. Med. Res. - 1983. - Vol. 11. - P. 285-295.

  • 9.    Davis B.J. Disc electrophoresis. II. Method and application to human serum proteins // Annals of the NY Academy of Science. -1964. - Vol. 121. - P. 404-427.

  • 10.    Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding // Anal. Biochem. -1976. - Vol. 72. - P. 248254.

  • 11.    Meon S., Protein, esterase and peroxidase patterns of phytophtora isolates from Cocoa in Malaysia // J. Islamic Acad. Sci. - 1988. - Vol. 1. - # 2. - P. 154-158.

  • 12.    Nei M. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals // Genetics. -1978. - Vol. 89. - #3. - P. 583-590.

  • 13.    Lef e vre F., Charrie A. Isozyme diversity within African manihot germplasm // Euphytica. -1992. - Vol. 66. - P. 73–80.

  • 14.    Вейр Б. Анализ генетических данных. М.: Мир. 1995. - C. 132-135.

• • References

  • 1.    Tyagi I.D., Variability and correlation studies in bottle gourd (Lagenaria siceraria). // Indian J. Hort. - 1972. - Vol. 29. - #2. - P. 219-222.

  • 2.    CHesnokov Yu.V. Molekulyarno-geneticheskie markery i ih ispol'zovanie v predselek-cionnyh issledovaniyah. SPb: AFI, 2013. - 116 р.

  • 3.    Markert C.L., Moller F. Multiple forms of enzymes; tissue, ontogenic and species patterns. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1959. - Vol. 45. - P. 753-763.

  • 4.    Tanksley, S.D., Orton T.J., (eds) Isozymes in Plant Genetics and Breeding. North-Holland Publ. Co. Amsterdam. 1983.

  • 5.    Harris H. Enzyme polymorphism in man. // Proc. Roy. Soc. (London) -1966. - Vol. 164. - P. 298-310.

  • 6.    Bailey D.C., Isozymic variations and plant breeder rights. In: S.D. Tanksley and T.J. Orton (eds). Isozymes in plant genetics and breeding, Part A, Elsevier, Amsterdam. -1983. - P. 425-440.

  • 7.    Shaw S.R. Isozymes: classification, frequency, and significance // Int. Rev. Cytol. -1969. - Vol. 25. - P. 297-332.

  • 8.    Brown A.H., Clegg M.T., Isozyme assessment of plant genetic resources // Isozymes Curr. Top. Biol. Med. Res. - 1983. - Vol. 11. - P. 285-295.

  • 9.    Davis B.J. Disc electrophoresis. II. Method and application to human serum proteins // Annals of the NY Academy of Science. -1964. - Vol. 121. - P. 404-427.

  • 10.    Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding // Anal. Biochem. -1976. -Vol. 72. - P. 248-254.

  • 11.    Meon S., Protein, esterase and peroxidase patterns of phytophtora isolates from Cocoa in Malaysia // J. Islamic Acad. Sci. - 1988. - Vol. 1. - # 2. - P. 154-158.

  • 12.    Nei M. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals // Genetics. -1978. - Vol. 89. - #3. - P. 583-590.

  • 13.    Lef e vre F., Charrie A. Isozyme diversity within African manihot germplasm // Euphytica. -1992. - Vol. 66. - P. 73–80.

  • 14.    Weir B. Analiz geneticheskih dannyh. M.: Mir. 1995. - P. 132-135.