Изучение популяций патогенных листерий в объектах окружающей среды с использованием сканирующей электронной микроскопии

Накопление данных о сапрофитическом существовании патогенных микроорганизмов привело к пересмотру места возбудителей ряда инфекционных заболеваний в различных экосистемах (1-4). В последнее десятилетие специалисты по пищевым токсикоинфекциям все больше внимания уделяют возбудителю листериоза, случаи передачи которого с растительными продуктами существенно участились.

Несмотря на значительное число публикаций по эпизоотологии, эпидемиологии, молекулярной биологии патогена, фармакологии, иммунологии, генетике и клиническим особенностям заболевания, экология возбудителя листериоза изучена мало (1, 5, 6). В то же время известно, что листерии достаточно устойчивы к неблагоприятным факторам, могут расти при низких значениях рН, высокой концентрации NaCl, проявляют свойства микроаэрофилов и психрофилов. Как типичные представители сапронозов листерии способны размножаться в почве, перемещаться с грунтовыми водами и подниматься в слои с вегетирующими побегами однолетних растений, в том числе кормовых.

Впервые вопрос о существовании природных резервуаров возбудителей инфекций во внешней среде поднял В.И. Терских (4). В настоящее время признается, что изучать фундаментальные и прикладные аспекты этой проблемы необходимо с широких биологических позиций на основе популяционно-экологических подходов (7, 8). Адаптация патогенов сопровождается гетероморфизмом и изменением физиологии клеток, способствующим уменьшению энергии роста (в частности, снижением фермента- тивной активности в отношении ряда субстратов) (9), что часто осложняет идентификацию изолятов.

При изучении жизненных форм листерий в разных средах мы использовали 48-часовую культуру Listeria innocua (10) в S-форме с типичными культурально-биохимическими свойствам. Взаимодействие листерий с растениями исследовали по авторской методике моделирования проникновения листерий через корневую систему в вегетативные органы с применением метода сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) и оценкой динамики выживаемости бактерий (10). СЭМ проводили на электронном микроскопе Hitachi-800 со сканирующей приставкой Hitachi-8010 (Япония) при ускоряющем напряжении 75 кВ и инструментальном увеличении х1-10 тыс. (10). Пищевые продукты в стерильных емкостях контаминировали взвесью листерий (5*10⁸ КОЕ/мл) и оставляли при комнатной температуре на 3 ч, затем помещали в разные температурные условия (18-22 °С на 3 сут, 4 °С на 3 сут, -8 и -18 °С на 10 сут), после чего отбирали пробы для бактериологического анализа и СЭМ.

О морфологической пластичности листерий (рис. 1) свидетельствовало наличие овоидных клеток (типичны для S-колоний), в разных условиях превращающихся в палочковидные, в клетки протопластного типа, нитевидные, мелкие округлые (L-формы), извитые формы, что присуще бактериям на стадиях L-трансформации. Широкая экологическая толерантность, сопровождающаяся изменением морфологических особенностей популяций, затрудняет первичную индикацию и идентификацию листерий в объектах ветеринарно-санитарного надзора.

При пониженных температурах, угнетающих большинство мезофильных патогенов, листерии не встречают конкуренции и могут активно размножаться (11). По данным В.С. Зуева с соавт. (12), при температуре 4-6 °С у сальмонелл в воде наблюдается L-трансформация (12). Мы отмечали (рис. 2, А), что листерии в воде в колониях и микроколониях сохраняли типичную палочковидную форму и были объединены межклеточным матриксом, формирующим покровы, что свидетельствовало о наличии полноценной клеточной стенки. Отрицательные температуры (от -8 до -18 °С) не влияли на морфологию и жизнеспособность популяций листерий (13, 14). Они поддерживали жизнеспособность при низких положительных и даже отрицательных температурах, существуя в колониях и микроколониях с поверхностной биопленкой (см. рис. 2, Б, В), образованной внеклеточными продуктами, аналогичными компонентам клеточной стенки, синтезируемым и секретируемым полноценной бактерией (15). Известно, что у энтеропатогенных бактерий основу биопленки составляют адгезины белковой и полисахаридной природы (16). Стратегия выживания популяций листерий в голодной среде (водопроводная вода) при разных температурах основана на гетероморфизме с различными проявлениями L-трансформации, что расширяет возможности поддержания их численности и циркуляции в межэпидемиологические периоды (13).

Свойство листерий не только выживать, но и размножаться при пониженных температурах обусловлено адаптационными механизмами, присущими психрофилам. В первую очередь, это так называемая гомео-вязкостная адаптация — изменение состава жирных кислот в липидах мембран в соответствии с температурой окружающей среды. При понижении температуры содержание ненасыщенных жирных кислот повышается, чем предотвращается замерзание липидов и избыточная жесткость мембран. К другим подобным факторам относится способность компенсировать малую эффективность рибосом при низких температурах их дополни- тельным образованием, что проявляется в увеличении содержания РНК. Кроме того, адаптация психрофилов связана с конформационными изменениями белков под действием термолабильных ферментов (17-19).

Все чаще регистрируют вспышки листериоза при употреблении в пищу мясных и молочных продуктов (6, 20, 21). Мы показали, что после контаминации листериями их колониеобразующая активность при 4 °C за 7 сут в стерилизованном молоке увеличивалась на четыре порядка, в кисломолочных продуктах — на три, в сырах — на два (22). Следовательно, наличие даже небольшого числа листерий способно привести к бурному развитию популяции до опасного для здоровья количества. В условиях пониженных температур было установлено, что, как и в водной среде, одна часть популяции существует в колониях и микроколониях с межклеточным матриксом, формирующим покровы (биопленки), другая — находится на разных стадиях гетероморфизма, что свидетельствует о фенотипической гетерогенности популяций (рис. 3, А, Б, В).

Изучение морфологии и особенностей развития листерий в стеблях кормового овса сорта Улов (10) позволило констатировать, что эти микроорганизмы из почвы через корневую систему проникают внутрь вегетативных органов. Так, в гомогенате корней число листерий было выше, чем в гомогенате листовых пластинок. Внутри листовых пластинок на всех сроках наблюдения был выявлен гетероморфизм листерий с дефектной клеточной стенкой (рис. 4, А). Из морфологических вариантов отмечали бактерии с измененной формой, нарушенным механизмом деления, с потерей способности к адгезии и колонизации, что, как известно, ведет к утрате патогенных свойств, образование клеток протопластного типа. При благоприятных условиях гетероморфные клетки реверсировали в исходную форму с сохранением морфологических и физиологических свойств (10). Стратегия выживания популяций листерий в растении определяется комплексом его механизмов защиты, действие которых вызывает разрушение клеточной стенки, что приводит к различным проявлениям L-трансформации и образованию нестабильных L-форм, способных к реверсии в исходное состояние. Этот процесс расширяет возможности возбудителя поддерживать численность и накапливаться в зеленых кормах (23).

Контаминации кормов листериями также способствует адгезия и колонизация твердых частиц кормов (24). С использованием СЭМ было показано, что при пониженных температурах и повышенной влажности в течение 24 ч клетки прикреплялись к поверхности дробленого зерна с последующим формированием микроколоний и колоний (см. рис. 4, Б), то есть происходило активное размножение листерий. При повышении температуры адгезия и колонизация замедлялись вследствие психрофиль-ности этих бактерий.

Таким образом, популяции листерий в разных объектах (вода, зеленые растения, зерно, продукты питания) в диапазоне температур от -18 до +37 °C адаптируются к меняющимся условиям, проявляя гетероморфизм с различными элементами L-трансформации, что обеспечивает длительную персистенцию. L-трансформация существенно затрудняет индикацию листерий, так как нередко видимого роста при культивировании таких бактерий на питательных средах не наблюдается.

Собственные исследования и анализ данных литературы позволили нам назвать основные адаптационные механизмы, обеспечивающие сохранение жизнеспособности у листерий. Это фенотипическая гетерогенность (гетероморфизм с различными проявлениями L-трансформации); возможность формировать микроколонии и колонии по типу многоклеточного 32

организма; целостность популяции за счет внутрипопуляционных связей, отсутствующих у единичных клеток, и ее способность реагировать на воздействие среды обитания (9).

Из-за способности нестабильных L-форм инициировать новые колоний посредством реверсии в исходную форму В.Д. Тимаков и Г.Я. Коган назвали процесс L-трансформации «транзитной системой» (25). Такой адаптационный механизм, проявляющийся изменением биохимических и морфологических свойств в популяциях, способствует выживанию вида бактерий и создает опасность возникновения инфекционного очага (9).

Итак, с применением неинвазивной сканирующей электронной микроскопии изучен гетероморфизм, воздействие абиотических и биотических факторов среды на популяцию, способность к реверсии, процессы адгезии и колонизации и пр. у листерий, что дало объективную информацию об их популяциях в среде обитания и расширило представление о структурно-функциональных особенностях патогенных организмов в целом. В широком смысле это позволяет по-новому подойти ко многим практическим проблемам воздействия на возбудителей как в среде обитания, так и в макроорганизме, в том числе обосновать подбор новых дезинфицирующих средств и лекарственных препаратов.