Изучение поврежденности ДНК клеток культуры HeLa методом ДНК-комет при комбинированном воздействии ультразвуком и 5-фторурацилом

Автор: Франциянц Елена Михайловна, Сурикова Екатерина Игоревна, Горошинская Ирина Александровна, Моисеенко Татьяна Ивановна, Назаралиева Нелли Альбертовна, Потемкин Дмитрий Сергеевич, Васильченко Никита Геннадьевич

Журнал: Сибирский онкологический журнал @siboncoj

Рубрика: Лабораторные и экспериментальные исследования

Статья в выпуске: 5 т.18, 2019 года.

Бесплатный доступ

Для понимания механизма эффективности локального применения 5 % геля 5-фторурацила (5-ФУ) с одновременным контактным ультразвуковым (УЗ) воздействием на опухоль у больных раком шейки матки в модельных условиях был изучен уровень поврежденности ДНК. Использована культура аденокарциномы шейки матки HeLa CCL-2, культивированная в стандартных условиях в среде RPMI-1640 с добавлением 10 % фетальной сыворотки теленка и 50 мкг/мл гентамицина. Воздействие ультразвуком осуществляли с помощью аппарата УЗТ-1.03У (Россия) в течение 10 мин с частотой 0,88 МГц и интенсивностью 0,2 Вт/см2. Доза 5-ФУ составила 0,7 мкМ, время воздействия 24 ч. Через 24 ч после начала воздействия уровень поврежденности ДНК клеток культуры исследовали методом ДНК-комет (Comet Assay) в щелочном варианте и оценивали по параметру % ДНК в хвосте кометы (% TDNA). Комбинированное воздействие УЗ/5-ФУ приводило к статистически значимому увеличению % TDNA -в 5,2 раза по сравнению с контрольной культурой, при этом % TDNA был в 1,9 раза выше показателя после воздействия только 5-ФУ и в 3,0 раза выше показателя после воздействия УЗ. Через 24 ч после комбинированного воздействия менее 50 % клеток культуры имели низкий уровень поврежденности ДНК (30 % TDNA) и, вероятно, находились в процессе апоптоза. Таким образом, комбинированное воздействие УЗ/5-ФУ на культуру HeLa способствовало преодолению резистентности к химиопрепарату, оказывая синергический эффект.

Еще

Поврежденность днк, днк-кометы, культура hela, 5-фторурацил, ультразвук, химиорезистентность, рак шейки матки

Короткий адрес: https://sciup.org/140254289

IDR: 140254289 | DOI: 10.21294/1814-4861-2019-18-5-68-73

Текст научной статьи Изучение поврежденности ДНК клеток культуры HeLa методом ДНК-комет при комбинированном воздействии ультразвуком и 5-фторурацилом

Одной из наиболее частых злокачественных опухолей женских половых органов является рак шейки матки (РШМ), при этом наблюдается рост заболеваемости среди женщин репродуктивного возраста – до 40 лет. Данный вид опухоли характеризуется высокой частотой местнораспространенных и первично нерезектабельных форм, долгое время он считался условно химиорезистентным [1–3]. Актуальной проблемой современной онкологической помощи таким больным является повышение эффективности противоопухолевого лечения при одновременном ослаблении токсических эффектов вводимых в организм пациента химиопрепаратов. Большое значение при этом имеет терапия больных в предоперационном периоде [4, 5]. Системная неоадъювантная полихимиотерапия, дополненная локальным применением 5 % геля 5-фторурацила (5-ФУ) и одновременным контактным ультразвуковым воздействием на опухоль, способствовала не только улучшению непосредственных результатов (увеличению частоты частичной и полной регрессии опухоли, уменьшению количества курсов неоадъювантной химиотерапии и кумулятивной дозы химиопрепаратов), но и снижению общетоксического действия противоопухо-левых препаратов [6].

С целью понимания механизма эффективности такой модификации системной неоадъювантной химиотерапии больных раком шейки матки in vitro был изучен уровень поврежденности ДНК клеток аденокарциномы эндометрия человека (линия HeLa) при комбинированном воздействии на культуру клеток ультразвуком и 5-фторурацилом.

Материал и методы

В работе использована адгерентная культура клеток аденокарциномы шейки матки человека линии HeLa CCL-2, содержащей вирус папилломы человека HPV-18, 2 уровень биобезопасности. Куль- тивирование проводили в 12-луночных планшетах в среде RPMI-1640 («Биолот», Россия) с добавлением 10 % фетальной сыворотки теленка (Termo Scientific Hyclone, США) и при концентрации гентамицина 50 мкг/мл («Биолот», Россия) в стандартных условиях в мультигазовом инкубаторе CB 150 (Binder, Германия) при 37 ºС, 5 % СО2, влажность 95 %. Клетки засевали в количестве 3×105 клеток на 3 мл питательной среды в лунку. При достижении 70–80 % уровня конфлюэнтности осуществляли воздействие ультразвуком в течение 10 мин, 5-ФУ в дозе 0,7 мкМ в течение 24 ч и комбинированное воздействие УЗ/5-ФУ. Ультразвуковое воздействие осуществляли с использованием аппарата УЗТ-1.03У (Россия) с частотой колебаний 0,88 МГц и интенсивностью 0,2 Вт/см2 (среднечастотное низкоинтенсивное воздействие). Время озвучивания и доза 5-ФУ были подобраны в предварительных экспериментах – достижение выраженного цитотоксического эффекта при дозах значительно ниже ЛД50 [7]. Определение общего количества клеток и соотношения живых и мертвых (нежизнеспособных) клеток проводили с использованием 0,4 % раствора трипанового синего в камере Горяева.

Через 24 ч после воздействия исследовали уровень поврежденности ДНК-методом гель-электрофореза единичных клеток (метод ДНК-комет) в щелочном варианте, согласно рекомендациям [8], протокол описан в работе Тарнопольской и соавт. [9]. После трипсинизации культуры и центрифугирования готовили суспензию клеток в 1 % легкоплавкой агарозе в конечной концентрации 2×105 кл/мл. Далее готовили слайды [9]: в двух экспериментах по два слайда на каждую точку в одной постановке – всего по 8 слайдов на каждую экспериментальную точку. Затем проводили лизис в течение 1 ч при 4 ºС в буфере (2,5 М NaCl, 0,1М Na2EDTA, 0,01М трис-(гидроксиметил)-аминометан, 1 % тритон Х-100, рН=10). Денатурацию проводили в течение 20 мин

Таблица 1

Динамика показателя поврежденности ДнК клеток культуры Hela при воздействии на культуру ультразвуком и 5-фторурацилом

Параметр	Контрольная культура – через 24 ч	Через 24 ч после воздействия 10 мин УЗ	Через 24 ч после воздействия 0,7 мкМ 5-ФУ	Через 24 ч после воздействия 10 мин УЗ + 0,7 мкМ 5-ФУ
Доля живых клеток	98 %	92,5 %¹	89 %¹	72,5 %^1,2,3
		% TDNA
Базальный уровень	4,95 ± 0,26	8,54 ± 1,39¹	13,44 ± 1,10^1,2	25,89 ± 2,0^1,2,3
Позитивный контроль	47,41 ± 1,92	62,0 ± 2,79¹	64,29 ± 2,2¹	70,0 ± 2,32^1,2

Примечания: 1 – различия значимы по сравнению с показателем в контрольной культуре (p<0,05); 2 – различия значимы по сравнению с показателем в культуре после воздействия ультразвуком (p<0,05); 3 – различия значимы по сравнению с показателем в культуре после воздействия 5-ФУ (p<0,05).

Таблица 2

Динамика доли ДнК-комет с различным уровнем поврежденности ДнК при воздействии на культуру Hela ультразвуком и 5-фторурацилом

Параметр	Контрольная культура – через 24 ч	Через 24 ч после воздействия 10 мин УЗ	Через 24 ч после воздействия 0,7 мкМ 5-ФУ	Через 24 ч после воздействия 10 мин УЗ + 0,7 мкМ 5-ФУ
Доля живых клеток	98 %	92,5 %¹	89 %¹	72,5 %^1,2,3
Доля нежизнеспособных клеток	2 %	7,5 %¹	11 %¹	27,5 %^1,2,3
		Доля «комет»
<10 %	87,5 %	74,5 %¹	62,5 %¹	45,2 %^1,2,3
% TDNA 10–30 %	10,3 %	18,3 %¹	24,0 %¹	23,8 %¹
>30 %	2,2 %	7,2 %¹	13,5 %¹	31,0 %^1,2,3

Список литературы Изучение поврежденности ДНК клеток культуры HeLa методом ДНК-комет при комбинированном воздействии ультразвуком и 5-фторурацилом

Мерабишвили В.М., Бахидзе Е.В., Лалианци Э.И., Урманчеева А.Ф., Красильников И.А. Распространенность гинекологического рака и выживаемость больных. Вопросы онкологии. 2014; 60(3): 288-297.
Кит О.И., Франциянц Е.М., Меньшенина А.П., Моисеенко Т.И., Ушакова Н.Д., Попова Н.Н., Якушин А.В. Роль плазмафереза и ксенонотерапии в коррекции острых последствий хирургической менопаузы у больных раком шейки матки. Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета. 2016; 117. URL: http://ej.kubagro.ru/2016/03/pdf/29.pdf. (дата обращения: 24.01.2019).
Аксель Е.М., Виноградова Н.Н. Статистика злокачественных новообразований женских репродуктивных органов. Онкогинекология. 2018; 27(3): 64-78.
Меньшенина А.П., Моисеенко Т.И., Ушакова Н.Д. Возможности оптимизации предоперационной полихимиотерапии у больных инвазивным раком шейки матки. Злокачественные опухоли. 2014; (3): 30-36. DOI: 10.18027/2224-5057-2014-3-30-36
Меньшенина А.П., Моисеенко Т.И., Франциянц Е.М., Ушакова Н.Д., Назаралиева Н.А. Сравнительная оценка различных модификаций предоперационной полихимиотерапии у больных местно-распространенным раком шейки матки. Фундаментальные исследования. 2015; (1-8): 1629-1633.

Еще

Статья научная