Изучение противоопухолевой активности индол-3-пропионовой кислоты и ее комбинации с химиопрепаратами в исследовании in vivo

Ежегодно в Российской Федерации регистрируется около 300 000 случаев смерти от злокачественных новообразований, при этом отмечается устойчивый рост заболеваемости. По распространенности рак желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) занимает лидирующее положение [1]. Среди них колоректальный рак (КРР) является одним из наиболее часто диагностируемых и представляет собой серьезную медико-социальную проблему [2, 3]. Широко применяемые методы лечения, включая хирургию, лучевую и химиотерапию, влекут за собой ряд серьезных ограничений, главными из которых являются неспецифичность воздействия, цитотоксичность в отношении здоровых клеток и развитие резистентности [4]. Это обусловливает необходимость поиска новых эффективных и малотоксичных препаратов с избирательным противоопухолевым действием.

В последние годы активно изучается роль микробиоты в онкогенезе и эффективности терапии [5–7]. Показано, что состав микробного сообщества ассоциирован с ответом на лечение при различных типах рака, включая опухоли ЖКТ [8]. Одним из ключевых механизмов влияния микробиома является модуляция иммунного ответа, в частности, через активацию арилгидрокарбонового рецептора (AhR) и подавление активности гистондеацетилаз [9].

Индол-3-пропионовая кислота (ИПК) – важный метаболит микробиоты, который образуется при деградации триптофана. Продемонстрировано ее прямое противоопухолевое действие при раке молочной железы посредством активации AhR и рецептора прегнана X (PXR) [10], а также способность улучшать ответ на иммунотерапию ингибиторами контрольных точек у пациентов с немелкоклеточным раком легкого. Предполагает- ся, что ИПК модулирует дифференцировку CD8 + T-клеток, способствуя формированию популяции предшественников истощенных T-клеток через эпигенетические механизмы [11].

Хотя связь между составом микробиома и эффективностью терапии рака ЖКТ установлена [8], роль ИПК в этом процессе остается малоизученной. Учитывая полученные данные для других нозологий, можно предположить потенциал ИПК в повышении эффективности лечения злокачественных новообразований ЖКТ.

Цель исследования – оценить противоопухолевую активность индол-3-пропионовой кислоты in vivo на модели колоректального рака мыши.

Материал и методы

Реципиентами опухолевого материала являлись мыши линии Balb/c в возрасте 7–9 нед, массой 22–25 г. Животных содержали в SPF-зоне вивария ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России в системе индивидуально-вентилируемых клеток при температуре 21–23 °C и влажности воздуха в помещениях 40–70 %. Режим день/ночь составлял 12/12 ч. Животным ad libitum предоставлялись корм и вода, которые предварительно автоклавировали.

Для создания моделей использовали опухолевую культуру линии клеток колоректальной карциномы мыши (CT26) – это паспортизированная клеточная линия аденокарциномы толстой кишки мыши («AddexBio», США). Культуру опухолевых клеток вводили подкожно в правый бок мыши в количестве 5×106 клеток на мышь в объеме 0,2 мл питательной среды RPMI-1640, дополненной 10 % эмбриональной бычьей сывороткой («Gibco», США). В работе использовали препараты ИПК («Sigma-Aldrich», США), оксалиплатин-РОНЦ (ОХА) (РОНЦ им. Н.Н. Блохина Минздрава России, Россия) и 5-фторурацил (5-FU) (ООО «Компания Деко», Россия).

Оценку состояния животных, их взвешивание и замеры опухолевых узлов выполняли два раза в неделю (Вт, Пт) в течение 4 нед.

Объем опухолевых узлов вычисляли по формуле [12]:

V=LW2/2, где L и W – линейные размеры опухоли (длина и ширина, соответственно).

После достижения опухолевыми узлами объема 50–60 мм³ животных рандомизировали на 6 групп (n=7) с выравниванием по среднему объему опухоли для минимизации исходных различий между когортами. Животные первой группы получали ИПК внутрижелудочно через зонд в виде суспензии в 1 % крахмальном клейстере в дозе 6 мг/кг 3 раза в неделю; животные второй группы – 5-FU внутрибрюшинно в дозе 25 мг/кг 3 раза в неделю; животные третьей группы – ОХА внутрибрюшинно в дозе 10 мг/кг 3 раза в неделю; животные четвертой группы – комбинацию ИПК (6 мг/кг, внутрижелудочно) и 5-FU (25 мг/кг, внутрибрю- шинно); животные пятой группы – комбинацию ИПК (6 мг/кг, внутрижелудочно) и ОХА (10 мг/кг, внутрибрюшинно). Объемы всех вводимых препаратов составляли 0,2 мл. Шестая контрольная группа получала эквивалентные объемы растворителей: 0,9 % раствор NaCl внутрибрюшинно и 1 % крахмальный клейстер внутрижелудочно 3 раза в нед. Экспериментальную терапию проводили в течение 3 нед. По окончании введения препаратов выполнялось наблюдение в течение еще 1 нед. Таким образом, продолжительность всего эксперимента составила 4 нед [10]. Эффективность терапии оценивали по проценту торможения роста опухоли (ТРО, %), рассчитанному по формуле [12]:

ТРО (%)=(Vк – Vo) / Vк × 100 %, где Vк и Vo – средний объем опухоли (мм3) в контрольной и в сравниваемой опытной группе соответственно.

Дизайн эксперимента представлен в табл. 1. Манипуляции с животными проводились в соответствии с правилами Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для исследовательских и других научных целей (Страсбург, 1986) [13].

Для статистического анализа данных использовали программное обеспечение Microsoft Excel 2013 и Statistica 10. Для сравнения показателей между группами применяли непараметрический U-критерий Манна–Уитни. Различия считали статистически значимыми при уровне p≤0,05. Данные в таблицах представлены как медиана, 1 и 3 квартили. Для контроля уровня семейной ошибки при проведении множественных сравнений была применена поправка Бонферрони.

Результаты

Установлено, что на 25-й день эксперимента средние объемы опухолевых узлов в контрольной группе составили 987,4 ± 51,2 мм3, в группе, получавшей 5-FU, – 760,3 ± мм3, в группе, получавшей ОХА ,–795,9 ± 56,4 мм3, что в обеих группах в 1,2 раза ниже по сравнению с контролем, а в комбинированных группах в 1,4 раза ниже; так, в группе, получавшей ИПК в комбинации с 5-FU, – 671,5 ± ± 66,2 мм3, в группе, получавшей ИПК в комбинации с ОХА, – 690,6 ± 63,1 мм3 соответственно; в группе, получавшей ИПК, – 937,8 ± 62,5 мм3. Значимые различия с контрольной группой зарегистрированы в группах, получавших лечение 5-FU, ОХА (с 22-го дня эксперимента) (p=0,0485 и 0,0207 соответственно), а также в группах, получавших ИПК в комбинации с 5-FU и в комбинации ОХА (с 18-го дня эксперимента) (p=0,01086 и 0,0130 соответственно). Объемы опухолей в группе монотерапии ИПК и в контрольной группе оставались сопоставимыми на всех этапах проведения исследования. Динамика средних объемов опухолевых узлов представлена в табл. 2.

Несмотря на развитие опухолевой кахексии у животных контрольной группы, динамика средней

Таблица 1/table 1

Дизайн эксперимента по изучению противоопухолевой активности индол-3-пропионовой кислоты в монотерапии и в комбинации с химиопрепаратами the experiment design for studying the antitumor activity of indole-3-propionic acid in monotherapy and in combination with chemotherapy drugs