Изучение репаративного остеогенеза переломов бедренной кости кроликов при терапии обогащенной тромбоцитами плазмой

ПЛАЗМА ТРОМБОЦИТЛАРИ БИЛАН БОЙИТИЛГАН ТЕРАПИЯДА Қ УЁН СОН СИНИ Қ ЛАРИНИНГ РЕПАРАТИВ ОСТЕОГЕНЕЗИНИ ЎРГАНИШ

Сон суяги ёри қ лари бўлган қ уёнлар экспериментал моделида тромбоцитлар билан бойитилган плазма билан даволаш ор қ али репаратив остеогенез динамикаси ўрганилди. Тажриба ҳ айвонлари 3 гуру ҳ га ажратилди. 1 гуру ҳ интакт гуру ҳ и бўлиб, 6 та со ғ лом ҳ айвондан ташкил топган. 2-тажриба гуру ҳ ига мансуб 30 та қ уёнда даволаш ўтказилмади, 3-гуру ҳ даги 30 та ҳ айвонга тажрибанинг 3-кунидан бошлаб тромбоцитлар билан бойитилган аутолог плазма мушак ичига киритилди. 7,14,30,60 ва 90 кунлар динамикасидаги гистологик тад қ и қ отлар тажрибаларнинг 30 кунидан бошлаб киритилган тромбоцитларга бой плазма инъекциялари остеогенезни кучайтирганини тасди қ лади. 2-гуру ҳ ҳ айвонларида 30 кундан кейин суяк пластинкалари ҳ али шаклланмаганини, суякнинг ёри қ лари битмаганини, ёри ққ а эритроцитлар ажратаётган қ он томирлари мавжудлиги ани қ ланди. Суяк юзасига параллел йўналлган толалар ва фибробластлар типидаги ҳ ужайралар томонидан ҳ осил қ илинган суяк тў қ имасида остеобластлар топилган. 3-гуру ҳ қ уёнларида 30 кундан кейин ани қ шаклланган суяк тў қ имаси тузилмалари ани қ ланди: остеобластлар томонидан ҳ осил қ илинган суяк матрицасига қ ўшилган остеоцитлар - етук суяк ҳ ужайралари томонидан ҳ осил қ илинган концентрик пластинкалардан иборат суяк (остеон) ҳ осил бўлди. Гаверсов каналлари суякнинг асосий моддаси ҳ амда кўплаб остеоцитлар билан ўралгани кузатилди.

Калит сўзлар: найсимон суяк синишлари, гистоморфология, репаратив остеогенез, тромбоцитлар билан бойитилган аутолог плазма, қ уёнлар.

В настоящее время в медицине широко применяется технология лечения аутологичной плазмой обогащённой тромбоцитами (autologous platelet-rich plasma) – АПОТ (АPRP). Благодаря природным свойствам плазмы обогащённой тромбоцитами введение её в организм является одной из перспективных процедур в восстановлении тканей. После разрушения тромбоцитов АПОТ содержит α-гранулы, из которых после активации высвобождается множество факторов, таких как трансформирующий фактор роста-бета (TGF-β), фактор роста эндотелия сосудов (VGFF) и эпидермальный фактор роста (EGF) [1]. Доказана эффективность АPRP при заживлении ран и восстановлении тканей в челюстно-лицевой хирургии, кардиохирургии, офтальмологии, ортопедии, пластической хирургии, спортивной медицине и косметологии [2] .

В наших исследованиях АPRP-терапия апробирована на экспериментальной модели переломов костей конечностей кроликов с целью стимуляции регенерации костей и заживления послеоперационных ран. Терапевтические эффекты АПОТ всё ещё противоречивы из-за отсутствия оптимизированных и стандартизированных протоколов оптимальных условий центрифугирования цельной крови. Нами апробирована методика получения обогащенной тромбоцитами плазмы при двухэтапном центрифугировании аутологичной крови из ушной вены кролика на настольной центрифуге TDZ4-4Ws (Китай). Исходная концентрация тромбоцитов в обогащенной тромбоцитами плазме в среднем составляла 590,58±25,69 (109/л). Эффективность терапии АПОТ оценена по результатам изучения репаративного остеогенеза переломов бедренной кости кроликов при терапии обогащенной тромбоцитами плазмой

Цель исследования: патоморфологическая оценка процессов регенерации в динамике лечения экспериментальных переломов костей с применением аутологичной плазмой, обогащённой тромбоцитами.

Объект исследований: локальная стимуляция остеогенеза при терапии с применением плазмолифтинга посттравматических нарушений костной репаративной регенерации и их морфофункциональное состояние

Методы исследований:

экспериментальный, гистоморфологический.

Материалы

Экспериментальные прoведены на базе токсикологических исследований.

исследования отделов фармакоисследований и

клеточных технологий с электронной микроскопией Межвузовской научноисследовательской лаборатории ТМА.

Опыты проведены на 66-ти беспородных кроликах-самцах породы шиншилла весом 2,5-3,5 кг в возрасте 11-12 месяцев. Все опытные животные были разделены на 3 группы. 1-ую интактную группу составили 6 здоровых особей, во 2-ую и 3-ью опытные группы распределили по 30 особей в каждой. Во 2-й группе терапию аутологичной плазмой, обогащённой тромбоцитами (АПОТ) не применяли, в 3-ей группе терапия включала внутримышечное введение АПОТ, начиная с 3 суток опытов. Исследования проводились на 7,14,30, 60 и 90 сутки опытов. Выбранные сроки наблюдения являются наиболее показательными для визуализации процессов, происходящих в костной ткани после переломов. В ходе работы соблюдались правила проведения медикобиологических исследований с использованием животных в соответствии с международными рекомендациями [3,4,5,6]. Лабораторные животные содержались в стандартных условиях вивария и находились на полноценном лабораторном пищевом рационе при свободном доступе к воде. Им был обеспечен растительный витаминизированный рацион. Все кролики перед работой были дегельминтизированы. С момента начала и в течении всего срока эксперимента животные были обследованы на наличие интеркурентных заболеваний. При их наличии животное выводили из эксперимента. Все животные были пронумерованы по принципу их происхождения и расположения клеток. После 2-х недельного карантина кролики были тщательно осмотрены, учитывались внешний вид, двигательная активность и реакция на рефлексы. Оперативные вмешательства проводили в стерильных условиях с соблюдением правил асептики и антисептики под общей анестезией (кроликам под общим наркозом (атропин 0,1% в/м, через 5 мин димедрол 0,7 в/м, ксилозин 1,0 в/м, через 10 мин телозол 0,2 в/м) в стерильных условиях линейным разрезом в средней трети голени вдоль оси конечности обнажали диафиз большеберцовой кости, для создания дефекта кости использовали стоматологическую бор-машину, при помощи которой выполнили модель оскольчатого перелома. Рану ушивали, кожу вокруг раны обрабатывали бетадином (1 мг раствора содержит 100 мг активного йода, что соответствует 10 мг повидон-йода), накладывали стерильную повязку. Кролики опытных групп первые двое суток получали внутримышечные инъекции витаминов и антибиотиков. Экспериментальные животные в послеоперационном периоде получали инфузионную и антибактериальную терапию с применением цефалоспоринов, обезболивающие средства. Животным опытной группы, начиная с 3-их суток после остеотомии, в 5-ти точках по периметру зоны раневой поверхности вводили внутримышечно по 0,2 мл обогащенной тромбоцитами плазмы. Всего за один сеанс вводили 1 мл ОТП. Плазмолифтинг проводили каждые 2 дня. Кроликам контрольной группы инъекции ОТП не проводились, рана обрабатывалась ежедневно раствором бетадина. Оперированных животных содержали по одиночке.

Результаты исследований.

Животным 3-ей опытной группы, начиная с 3-их суток после остеотомии, в 5-ти точках по периметру зоны раневой поверхности вводили внутримышечно по 0,2 мл обогащенной тромбоцитами плазмы. Всего за один сеанс вводили 1 мл ОТП. APRP-терапию проводили через каждые 2 дня. Кроликам 2 опытной группы APRP-лечение не проводилось, раны обрабатывались ежедневно раствором бетадина.

Животных выводили из эксперимента по 6 особей в сроки 7, 14, 30, 60 и 90 сутки после операции путем усыпления литической дозой «Изофурана» посредством ингаляционного наркоза до полной остановки сердца и дыхания.

Течение регенеративного процесса в зоне экспериментального перелома оценивалось гистоморфологическим анализом тканей костной мозоли из зоны перелома. Для морфологических исследований после забоя животных производили забор трубчатых костей задних конечностей. Макропрепараты фиксировали в 10% нейтральном растворе формалина на фосфатном буфере. При макроскопической оценке костей 6 кроликов контрольной группы учитывали такие показатели как внешний вид, архитектуру костных трабекул, степень разреженности костной ткани, наличие деструктивно-дегенеративных изменений мышечной ткани. В опытных группах при макроскопическом исследовании зоны остеосинтеза обращали внимание на прочность соединения отломков, наличие их смещения, расположение импланта и его влияние на окружающую ткань. Для проведения микроскопического исследования фрагменты трубчатых костей после фиксации в 800 спирте промывали водой и проводили декальцинацию с помощью этилендиаминотетрауксусной кислоты (ЭДТА, трилон Б) по Фрейману. Для чего 5% водный раствор ЭДТА доводили с помощью гидроксида натрия до рН 6,0-6,5. Деминерализацию проводили в первые 24 часа при температуре 40С и затем при комнатной температуре при регулярном контроле и смене раствора трилона Б до 24 суток. Кусочки фрагментов костной ткани заливали парафином – целлоидином и готовили срезы толщиной 5,0 мкм. Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином [7,8,9].

Светооптические микрофотографии при увеличении в 100 и 400 раз получали на цифровом бинокулярном микроскопе DN-300M, сопряжённым с цифровой камерой и компьютером. Для оценки характера регенераторного процесса после переломов трубчатых костей конечностей в опытных группах определяли видоспецифичность и архитектонику тканей, заполняющих пространство между костными отломками, качественный клеточный состав этой ткани. Оценивали количество остеобластов, остеоцитов и остеокластов, толщину и расположение трабекул, их пространственное расположение, количество и диаметр сосудов [10,11,12].

Течение регенеративного процесса в зоне экспериментального перелома оценивалось по рентгенологическим, денсиметрическим признакам и гистоморфологическому анализу тканей костной мозоли из зоны перелома на 7, 14, 30,60 и 90 сутки после остеотомии. Морфологический анализ костной ткани диафиза бедренной кости позволил изучить процессы новообразования костной ткани после внутримышечного введения 1 мл ОТП и оценить эффект ее действия на процесс репаративной регенерации.

В костной ткани диафиза бедренной кости кроликов изучена зрелая и незрелая кость. В незрелой кости доминировали клеточные элементы и не прослеживалась её пластинчатая структура. Матрикс в незрелой кости имел больше основного вещества. Гаверсовы канальцы в зрелой кости более минерализованы, чем в незрелой.

В костной ткани различаются следующие типы клеток:

• 1)    предшественники костных клеток -покоящиеся клетки, располагающиеся на границах как внутренней, так и наружной поверхностей кости.

• 2)    остеобласты - клетки близкие к фибробластам и хондробластам. Они сохраняют способность к делению. Эти клетки секретируют коллаген и ответственны за минерализацию костей,

• 3)    остеоциты - зрелые костные клетки, заключенные в костный матрикс, который секретируется остеобластами.

• 4)    остеокласты - большие многоядерные клетки, функция которых заключается в резорбции кости. По своей сути, остеокласты являются фагоцитами.

Зрелая кость слагается из цилиндрических единиц – остеонов или Гаверсовых систем. Остеон состоит из концентрически расположенных ламелл, матрикса кости, окружающих Гаверсовый канал, который содержит сосуды и нервы. Гаверсовы каналы соединяются между собой Фолькмановскими каналами.

Исследования микропрепаратов костной ткани диафиза бедренной кости показали, что дифференциация структур костной ткани не выражена на 7 и 14 сутки, в большом количестве выявлены покоящиеся

У животных 2 группы под условным названием «опытная без лечения», ОТП не вводили. Через 30 суток отмечено, что костные пластинки еще не сформированы, кость губчатого типа, кровеносные сосуды, содержащие эритроциты в просветах (рис.1). В надкостнице, образованной волокнами и клетками типа фибробластов, ориентированными параллельно поверхности кости, выявлены остеобласты (рис.2).

клетки.

Рис.1. 2 опытная группа без лечения. Бедренная кость кроликов через 1 месяц. Пластинки не сформированы, кость типа губчатой (чёрная стрелка), сосуды (красная стрелка). Окраска ГЭ. Ув.10х10.

Рис.2. 2 опытная группа без лечения. Надкостница бедренной кости кроликов через 1 месяц. В надкостнице (черная стрелка) остеобласты (синяя стрелка). Окраска ГЭ. Ув.10х10.

Микроскопические исследования показали, что дифференциация структур костной ткани эпифиза бедренной кости кроликов при внутримышечном введении 1 мл ОТП проявляется на 30 сутки опытов.

Через 1 месяц введения ОТП у кроликов 3 группы на микропрепаратах определяются сформированная кость, новообразованные костные балки, формирующие костные каналы. Сформированная кость

(остеон) состоит из концентрических пластинок, сформированных остеоцитами (рис.3). Новообразованные костные балки с оссеоидом в центре остеона, кровоснабжающий сосуд в Гаверсовом канале (рис.4). Гаверсовы каналы ориентированы преимущественно вдоль длинной оси кости и окружены основным веществом кости с многочисленными остеоцитами.

Рис.3. Костная ткань эпифиза бедренной кости кроликов 3 опытной группы через 30 суток введения ОТП. Сформированная кость (чёрная стрелка), новообразованные костные балки, формирующие костные каналы (красная стрелка). Сформированная кость (остеон) из концентрических пластинок, сформированных остеоцитами. В центре остеона кровоснабжающий сосуд в Гаверсовом канале (зелёная стрелка). Окраска ГЭ. Ув.10х10

Рис.4 . Костная ткань эпифиза бедренной кости кроликов 3 опытной группы через 30 суток введения ОТП. Новообразованные костные балки с оссеоидом (чёрная стрелка), формирующийся Гаверсов канал (красная стрелка). Остеоциты (синяя стрелка), остеобласты (жёлтая стрелка).

Окраска ГЭ. Ув.10х40.

Таким образом, результаты гистоморфологических исследований через 30 суток опытов свидетельствуют о положительном эффекте воздействия ОТП на процессы регенерации костных переломов у животных. Установлена четкая дифференциация структур костной ткани. Через 30 суток сформирована кость (остеон), состоящая из концентрических пластинок, сформированных остеоцитами - зрелыми костными клетками, заключенными в костный матрикс, который секретируется остеобластами. Гаверсовы каналы окружены основным веществом кости с многочисленными остеоцитами.

Через 60 суток наблюдения во 3 опытной группе на декальцинированных срезах поверхности костной ткани не определяются посторонние включения и наложения. Результаты гистоморфологических исследований через 60 суток опытов свидетельствуют о положительном эффекте воздействия ОТП на процессы регенерации костных переломов у животных. Установлено, что сформированная пластинчатая кость преобладает над губчатой костью (рис.5). В костной ткани пластинчатая кость преобладает над губчатой, множество остеонов (рис.6), остеокластов, остеобластов, остеоцитов, в Гаверсовом канале сосуды кровенаполнены (рис.7).

Рис.5. Костная ткань эпифиза бедренной кости кроликов 3 опытной группы через 60 суток введения ОТП. Сформированная пластинчатая кость (чёрная стрелка) преобладает над губчатой костью (красная стрелка). Окраска ГЭ.

Ув.10х10.

Рис.6. Костная ткань эпифиза бедренной кости кроликов 3 опытной группы через 60 суток введения ОТП. Остеоны (чёрная стрелка), губчатая кость (красная стрелка). Пластинчатая кость преобладает над губчатой.

Окраска ГЭ. Ув.10х40.

Рис.7. Костная ткань эпифиза бедренной кости кроликов 3 опытной группы через 60 суток введения ОТП. Остеокласты (чёрная стрелка), остеобласты (красная стрелка), остеоциты (синяя стрелка) сосуд в Гаверсовом канале (жёлтая стрелка). Окраска ГЭ.

Ув.10х40.

Несколько иная гистоморфологическая картина прослеживается во 2-ой опытной группе (без лечения). Так, через 30 суток опытов, в костной ткани преобладает губчатая ткань, остеононы не сформированы, немногочисленные остеобласты (рис.8). Костная ткань эпифиза бедренной кости кроликов состоит из губчатой кости. Пластинки полностью не сформированы, фиксируются немногочисленные остеобласты и остеоциты (рис.9).

В более отдалённые сроки наблюдения 90 суток костная ткань эпифиза бедренной кости кроликов 3 группы, которым в области перелома внутримышечно вводили ОТП, сформировалась пластинчатая ткань и выявлены многочисленные остеоны (рис.10), и зрелые костные пластинки (рис. 11).

В сравнительном аспекте у кроликов 2 группы, которым не вводили ОТП, через 90 суток опытов преобладает губчатая костная ткань, в которой встречаются единичные цилиндрические единицы зрелой кости – остеоны (рис.12), которые появлялись во 3 группе уже через 30 дней экспериментов. Также в костной 2 группы (без лечения) через 90 дней опытов по-прежнему преобладает губчатая ткань (рис.13)

Рис.8. Костная ткань эпифиза бедренной кости кроликов 2 опытной группы (без лечения) через 90 суток. Губчатая кость (чёрная стрелка), остеоны не сформированы (красная стрелка), остеобласты (жёлтая стрелка). Окраска ГЭ. Ув.10х10.

Рис.9. Костная ткань эпифиза бедренной кости кроликов 2 опытной группы (без лечения) через 90 суток. Губчатая кость (чёрная стрелка). Пластинки полностью не сформированы (красная стрелка). Остеобласты, остеоциты (жёлтая стрелка). Окраска ГЭ. Ув.10х40.

Рис.10. Костная ткань эпифиза бедренной кости кроликов 3 опытной группы через 90 суток введения ОТП. Сформирована пластинчатая ткань. Многочисленные остеоны (чёрная стрелка). Окраска ГЭ. Ув.10х10.

Рис.11. Костная ткань эпифиза бедренной кости кроликов 3 опытной группы через 90 суток введения ОТП. Пластинчатая костная ткань сформирована. Костные пластинки (чёрные стрелки). Окраска ГЭ. Ув.10х40.

Таким образом, результаты гистоморфологических исследований через 60 суток опытов свидетельствуют о положительном эффекте воздействия ОТП на процессы регенерации костных переломов у животных. Установлено формирование пластинчатой ткани, зрелые костные пластинки и выявлены многочисленные остеоны. Восстановление дефектов костной ткани происходит по типу полного заживления. Гистологические исследования подтверждают интенсивное остеообразование при инъекциях ОТП, начиная с 30 суток экспериментов.

Заключение. Морфологический анализ костной ткани эпифиза бедренной кости позволил изучить процессы новообразования костной ткани после плазмолифтинга и оценить эффект действия обогащенной тромбоцитами плазмы на процесс репаративной регенерации.

Результаты гистоморфологических исследований через 30 суток опытов свидетельствуют о положительном эффекте воздействия ОТП на процессы регенерации костных переломов у животных. Установлена четкая дифференциация структур костной ткани. В этот срок сформирована кость (остеон), состоящая из концентрических пластинок, сформированных остеоцитами -зрелыми костными клетками, заключенными в костный матрикс, который секретируется остеобластами. Гаверсовы каналы окружены основным веществом кости с многочисленными остеоцитами. Результаты гистологических исследований подтверждены контрольными рентгеновскими снимками восстановления дефектов костной ткани по типу полного заживления на 60 сутки опытов.

Доклинические исследования эффективности применения АПОТ в лечении диафизарных переломов трубчатых костей проведены согласно договору о научном сотрудничестве №01-20 от 11 февраля 2020 г. с Бухарским государственным медицинским институтом