Изучение содержания белка и липид-белкового соотношения в периферическом нерве крысы в норме и после травмы

Детальное понимание структуры миелина и функций белка на молекулярном уровне необходимы для того, чтобы полностью понять их физиологические роли в миелиновой оболочке.

Материалы и методы исследования. Объектами исследования послужили белые беспородные крысы массой 150-250 г. Материалом исследования послужили седалищные нервы крыс. Животных содержали в условиях вивария в индивидуальных клетках в условиях 12 часового дня и ночи со свободным доступом к пище и воде. Эксперименты на животных выполнены под хлороформным наркозом в стерильных условиях экспериментальной операционной. Все манипуляции с животными осуществлялись в соответствии с «Правилами проведения работы с использованием экспериментальных животных» (приказ Минвуза от 13.11.1984 г. № 724).

Для исследования животные были распределены на четыре группы. К первой группе относились животные без повреждения седалищного нерва (контрольная группа без введения антибиотика); ко второй группе – животные с раздавливанием нерва, выведенные из эксперимента на 7 день; третья группа – животные с раздавливанием нерва, выведенные из эксперимента на 14 день; четвертая группа – животные с раздавливанием нерва, выведенные из эксперимента на 21 день.

Для создания модели повреждения животным сдавливали седалищный нерв в верхней трети бедра под хлороформным наркозом. Сдавливание осуществлялось кровоостанавливающим незазубренным зажимом, в положении первого зубца в течение 30 сек [1], с последующим наложением швов на мышечные/кожные ткани и подкожным введением 100 мкл раствора гентамицина концентрации 40 мг/мл.

Отпрепарированные нервы помещались в раствор Рингера (6,5 г NaCl, 0,42 г KCl и 0,25 г CaCl2, растворенные в 1 литре бидистиллированной воды) для теплокровных с температурой 37° С и выдерживались там 15 мин, после чего проводились исследования.

Для достижения поставленных целей были применены биохимические методы (определение содержания белка в миелиновой фракции методом Петерсона, определение общего содержания белка биуретовым методом, выделение белков миелиновой фракции), а также современные спектральные методы анализа (КР-спектроскопия).

Выделение белков миелиновой фракции (W.Norton and S. Poduslo, 1973). Нервные волокна были гомогенизированы в ступке тефлоновым пестиком в 0,8 М сахарозе (рН 7,0) в соотношении 1:2 соответственно. Далее гомогенат переносили в пробирку (500 мкл) и наслаивали сверху раствор 0,32 М сахарозы (250 мкл). Центрифугирование проводилось при 18 000 g, 4° С в течение 1 часа.

Полученный белый межфазный слой (≈400мкл.) осторожно удаляли из каждой центрифужной пробирки, ресуспендировали в 0,8 М сахарозы (4 мл), а затем гомогенизировали.

К гомогенату (≈750 мкл) добавляли 0,32 М сахарозу (≈250 мкл.) (наслаиванием), центрифугировали при 18 000 g, 4° С в течение 60 мин. После центрифугирования, межфазный слой суспендировали в 0,24 М сахарозе, и центрифугировали при 10000 g в течение 10 мин с целью устранения загрязнения микросом.

Затем плотно упакованный осадок гомогенизировали в дистиллированной воде и снова центрифугировали при 10000 g в течение 10 мин.

Полученная белковая фракция состояла из сырого миелина и была использована для проведения дальнейших анализов.

Определение общего содержания белка биуретовым методом (A. Gornall, 1949). Метод основан на способности белков давать с раствором сернокислой меди фиолетовое окрашивание в щелочной среде. Для биуретовой реакции необходимо наличие двух ОН-групп и трех атомов азота, находящихся в полипептидной цепи. Группа, образующая пептидную связь (– ОС – NH –) в щелочной среде, присутствует в своей таутомерной форме. В избытке щелочи происходит диссоциация водорода енольной ОН-группы, при этом возникает отрицательный заряд, с помощью которого кислород, взаимодействуя с медью, образует соль; кроме того, медь образует дополнительные (дативные) связи с атомами азота пептидных связей. Возникший комплекс характеризуется высокой стабильностью.

В пробирки, содержащие 1 мл раствора белка соответствующего разведения приливали 4 мл биуретового реактива, перемешивали и оставляли при комнатной температуре на 30 мин.

Измеряли оптическую плотность раствора на спектрофотометре UVmini-1240 при 540 нм в 1 см кювете.

Содержание белка в исследуемых растворах рассчитывали по калибровочному графику.

Определение содержания белка в миелиновой фракции по Петерсону (G.Peterson, 1983). Данный метод характеризуется высокой чувствительностью (10 – 100 мкг белка), позволяет эффективно определять белок в мембранных фракциях.

К 1 мл исследуемого раствора, содержащего белок, приливали 1 мл реагента А, перемешивали и оставляли при комнатной температуре на 10 мин. Затем в пробирку с реакционной смесью добавляли 0,5 мл реактива В, тщательно перемешивали и через 30 мин определяли оптическую плотность раствора на спектрофотометре UVmini-1240 при 670 нм в 1 см кювете.

Содержание белка в исследуемых растворах рассчитывали по калибровочному графику.

Спектроскопия комбинационного рассеяния нерва (S. Morisaki, 2013). Комбинационное рассеяние света – это рассеяние света веществом, сопровождающееся заметным изменением частоты рассеиваемого света. В основе метода лежит взаимодействие монохроматического излучения (лазерного) с веществом, частицы которого испытывают периодические изменения [2]. Спектр КР исследуемого вещества – это зависимость интенсивности КР от частотного сдвига. Изменение положения максимума пика в спектре

КР или изменение относительной интенсивности пика связаны с изменением параметров связи/связей в молекуле и, следовательно, свидетельствуют об изменении конформации молекулы [3]. Одним из преимуществ КР спектроскопии является высокая чувствительность к незначительным изменениям в структуре исследуемых веществ, а также простота пробоподготовки и большой объем получаемой информации. Поэтому все, что требуется для сбора спектра – это направить падающий луч точно на образец, а затем собрать рассеянный свет.

Исследование конформации белков было выполнено на рамановском спектрометре in Via Raman Microscope фирмы Renishaw (Англия) с короткофокусным высокосветосильным монохроматором, фокусное расстояние которого не более 250мм. Для возбуждения рамановских спектров использовали лазер (длина волны излучения 532 нм, мощность излучения 5 мВт, объектив 5х). Регистратор данных – CCD детектор (1024х256 пикселей с пельтье-охлаждением до –700С) с решеткой 1800 штр/мм.

Результаты и обсуждение. В первой серии эксперимента нами было определено общее содержание белка в нерве биуретовым методом. Повреждение нерва приводит к уменьшению содержания белка. Так, через неделю после повреждения содержание белка снижается на 59,1% (рисунок 1). В течение следующих двух недель посттравматического периода содержание белка постепенно увеличивается и через 3 недели после нанесения повреждения лишь на 11,9% отличалось от контрольных значений (см. рис. 1).

Рис. 1. Количественное изменение содержания общего белка поврежденного периферического нерва в норме и после повреждения (р ≤0,05).

Полученные результаты объясняются тем, что после травмы седалищного нерва начинается дегенерация поврежденных тканей: происходят биохимические и биофизические изменения. Вес нерва и содержание в нем воды увеличиваются, понижается концентрация липоидов мякотной оболочки. Изменяется активность различных ферментов.

Постепенно в поврежденных нервах начинаются процессы регенерации, в основе которой лежит реакция нейронов на нарушенное равновесие в системе «нервная клетка – периферическое нервное окончание». Регенерация является сложным процессом восстановления этого равновесия, осуществляемого взаимодействием нервной клетки с центральным отрезком соответствующего нервного волокна, шванновским синцитием, соединительнотканными элементами.

Аналогично общим белкам нерва изменяется количество белка миелиновой фракции (см. рис. 2). Через 1 неделю после повреждения седалищного нерва происходит достоверное снижение концентрации белка на 16,68% по сравнению с контролем; далее с течением времени концентрация белка в миелиновой фракции увеличивается, причем становится больше контрольных значений на 3,47% и 23,4% через 2 и 3 недели после повреждения нерва соответственно.

Рис. 2. Количественное изменение содержания белка в миелиновой фракции по Петерсону (р ≤ 0,05).

При изучении процессов, происходящих в поврежденном периферическом нерве, нами были получены спектры комбинационного рассеяния в области 2800-3000 см-1, в этой области для анализа нами были взяты полосы интенсивности 2940 и 2853 см-1(рисунок 3).

Рис. 3. Спектр комбинационного рассеяния неповрежденного седалищного нерва.

В спектре КР неповрежденной нервной ткани отображаются три важных пика в области 2800-3000 см^-1. Анализ клеточных спектров предположил, что спектр седалищного нерва отражает компоненты аксона и миелина. Для миелина характерны полосы 2853 и 2885 см^-1 полученные от липидов, а периферическая нервная ткань содержит большое количество липидов в составе миелиновых оболочек, которые окружают аксоны. Миелин швановских клеток включает в себя сфингомиелин и гликолипид галактоцереброзид [4]. Полоса 2940 см^-1 соответствует C – H 3 симметричным валентным колебаниям, отражающим в основном содержание белка. Нервная ткань, структура, которая содержит много аксонов и белковых нейрофиламентов, последние в свою очередь, являются обильными фибриллярными компонентами цитоплазмы аксона. Нейрофиламенты состоят из полипептидных цепей с высоким содержанием остатков глутаминовой кислоты. Характерные полосы в спектре КР на 2940см^-1 и 2853 см^-1 определяют соотношение белкового компонента (белки аксона) к липидному компоненту (липиды миелина) путем деления 2940 см^-1 на 2853 см^-1.

В ходе анализа спектра КР в норме и при повреждении обнаружены следующие результаты: соотношение белок/липид через 1 неделю уменьшается на 9,1%; через 2 недели увеличивается на 18,6%; через 3 недели увеличивается на 92,1%; на 5 неделе увеличивается на 14,2% по сравнению с контролем.

Рис. 4. Количественный анализ соотношения интенсивностей полос (I 2940 /I 2853 ) для каждого момента времени (р ≤0,05).

Полученные результаты мы можем объяснить тем, что после валлеровской дегенерации количество аксонов увеличивается и шванновские клетки начинают ремиелинизироваться вокруг аксонов, что приводит к увеличению содержания белка и липидов и накоплению их в периферической нервной ткани [5]. Следовательно, этим явлением можно объяснить изменение количественного соотношения интенсивности полос (I2940/I2853) в сторону увеличения.

Заключение.

• 1.    Проанализировано содержание общего белка в норме и при повреждении и

• установлено, что с увеличением времени повреждения содержание его уменьшается. Через 1 неделю происходит уменьшение содержания общего белка на 59,1%; через 2 недели – на 39,2%; через 3 недели – 11,9% по сравнению с контролем.

• 2.    Определено содержание белка в миелиновой фракции в норме и после повреждения и показано, что через 1 неделю после повреждения содержание белка уменьшается на 16,7%; через 2 недели содержание белка увеличивается на 3,5%; через 3 недели содержание белка увеличивается на 23,4% по сравнению с контролем.

• 3.    Изучено соотношение белок/липид в норме и при повреждении. Получено, что соотношение максимально увеличивается через 3 недели.