Изучение сообщества микроорганизмов, выделенного из района солеразработок

В настоящее время остро стоит проблема очистки окружающей среды от полициклических ароматических углеводородов (ПАУ). Соединения этого класса обладают канцерогенным, мутагенным, токсичным эффектами и способны к аккумуляции природными объектами (Kanaly, Harayama, 2000). Существенный вклад в загрязнение почв и водоемов ПАУ вносят предприятия химической промышленности. В литературе описаны микроорганизмы и микробные сообщества, способные к эффективной деструкции нафталина, фенантрена и ряда других ПАУ (Пунтус и др., 1997; Суровцева и др., 1997; Плотникова и др., 2001; Бабошин и др., 2003; Boldrin et al., 1993). Такие штаммы-деструкторы и их ассоциации используются в биотехнологиях восстановления загрязненных территорий (Boonchan et al, 2000; Kanaly et al, 2000).

В ряде случаев почвенные и водные экосистемы, загрязненные ПАУ, подвергаются воздействию других неблагоприятных факторов, в частности, влиянию повышенной концентрации солей. Повышенное содержание солей в почвах ограничивает применение для их очистки биопрепаратов, содержащих штаммы микроорганизмов, неадаптированных к экстремальным условиям существования (Ward, Brock, 1978; Kastner et al., 1998; Hamme et al., 2003). Следовательно, особый интерес вызывает изучение микроорганизмов и их сообществ, способных к деструкции ПАУ, выделенных из экониш с высоким уровнем загрязнения и повышенным содержанием солей (Geiselbrecht et al., 1996; Hedlund et al., 1999; Chung, King, 2001).

Цель настоящего исследования - выделение и изучение сообщества микроорганизмов, перспек тивного для использования в биоремедиации высокоминерализованных почв, загрязненных ПАУ.

Методы исследования

Выделение микробного сообщества и штаммов бактерий. Образец почвы был отобран с глубины 5-10 см на расстоянии 10 м от солеот-вала (г. Березники, Пермский край). Для получения накопительной культуры 1 г почвы вносили в колбу (объем 250 мл), содержащую 100 мл минеральной среды Раймонда (Розанова, Назина, 1982), нафталин (0.1%), NaCI (6%) и инкубировали на термостатируемой качалке. УВМТ-12-250 при 100 об ./мин. и 28°С до появления микробного роста. Сообщество микроорганизмов выделяли путем многократных пересевов накопительной культуры и культивирования при вышеперечисленных условиях. Чистые культуры микроорганизмов выделяли на полноценной агаризованной среде Раймонда в присутствии 3% NaCI (Плотникова и др., 2001).

Динамика роста сообщества микроорганизмов и штаммов бактерий. Сообщество микроорганизмов и штаммы-деструкторы выращивали в колбах (объем 250 мл) в 100 мл минеральной среды Раймонда в присутствии разных (3%, 6%, 7.5%) концентраций NaCI и без соли, с нафталином (0.1%) в качестве единственного источника углерода и энергии на качалке УВМТ-12-250 (100 об./мин.) при 28°С. Измерение оптической плотности (OD) проводили на ФЭК-5 6М с длиной волны 540 нм в кюветах с длиной оптического пути 0.5 см.

Количество колониеобразующих единиц (КОЕ) определяли методом серийных разведений с последующим высевом и подсчетом колоний микроорганизмов на чашках с полноценной средой Раймонда в присутствии 3% NaCI.

Идентификация чистых культур бактерий. Морфологию и подвижность клеток исследовали с помощью световой микроскопии (микроскоп Leica DM LS, укомплектованный фазово-контрастным устройством).

Изучение физиолого-биохимических и хемо-таксономических признаков проводили согласно ранее описанным рутинным методам (Методы общей бактериологии, 1983; Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1991). Способность к росту микроорганизмов в присутствии разных концентраций хлорида натрия определяли при культивировании на полноценной модифицированной среде Раймонда (см. выше). Идентификацию выделенных штаммов проводили на основе морфологических, физиолого-биохимических и хемотаксономических характеристик с использованием “Определителя бактерий Берджи” (1997).

Результаты исследований и обсуждение

Выделение микробного сообщества и идентификация штаммов бактерий

Из высокоминерализованной и загрязненной отходами химических предприятий почвы методом накопительных культур изолировано микробное сообщество, обозначенное СМБ-3. Установлено, что состав сообщества сохраняется в течение 15-20 последовательных пересевов на селективные среды.

Эксперименты по выращиванию микробного сообщества на агаризованных и в жидких мине ральных средах показали, что СМБ-3 способно к росту на нафталине как единственном источнике углерода и энергии при высоких концентрациях соли (до 9 % NaCl в среде культивирования).

Путем высева на агаризованную полноценную среду, содержащую 3% NaCl, обнаружено семь различающихся по морфологии колоний штаммов бактерий, которые были отобраны для дальнейших исследований.

Грамположительные штаммы, обозначенные БЗ-7 и БЗ-8, представлены бледно-розовыми матовыми колониями, в молодых культурах преобладают неправильные удлиненные палочки или гифы, распадающиеся с возрастом на короткие палочковидные фрагменты и кокки (рис. 1, В). Штамм БЗ-7 на агаризованной среде образует субстратный мицелий. В гидролизатах целых клеток обоих штаммов присутствует мезо-диаминопиме-линовая кислота. У штаммов выявлены миколовые кислоты, идентичные таковым у представителей рода Rhodococcus. По перечисленным выше признакам штаммы отнесены к данному роду.

Из микробного сообщества выделены штаммы, способные к эффективному росту на полноценной среде Раймонда в присутствии до 29% хлорида натрия. Штаммы обозначены как БЗ-1 и БЗ-5 (таблица). Исследуемые индивидуальные культуры на полноценной среде образуют округлые, выпуклые, с ровным краем колонии палевого (штамм БЗ-1) и желтого (штамм БЗ-5) цвета. Клетки штаммов представляют собой грамотрицатель-ные, оксидазоотрицательные, каталазоположительные подвижные палочки (рис. 1, А, Б).

Рост бактериальных культур из микробного сообщества БЗ в присутствии ' различных концентраций хлорида натрия

Штамм	Полноценная среда Раймонда, % концентрации NaCl						Минеральная среда Раймонда с нафталином, % концентрации NaCl
	0	3	8	10	17	29	0	7.5	8	9
БЗ-1	—	+4-4-	4-4-4-	+++	+++	+	—		—	—
БЗ-2	4-4- Ь	+++	4*4—Н	+	—	—	—	—	—	—
БЗ-З	4-4-4-	4-4-4-	4-4-4-	4-++	—	—	—	—•	—	—
БЗ-4	+++	+++	+++	—	—	—	—	—	—	—
БЗ-5	++	4-+4	+++	+++	+++	+	—	—	—	—
БЗ-6	4-4*4-	4-4-4-	4-4-4*	—	—	—	—	—	—	—
БЗ-7	+++	+++	4-4-+	+	—	—	+++	+	—	—
БЗ-8	+++	+++	+++	+	—	—	+++	+++	4*4-4-	+

“-” - нет роста, “+ - +++” - степень выраженности роста

Б

Рис. 1. Морфология клеток: А - штамм БЗ-1, Б - штамм БЗ-5, В - штамм БЗ-8. Фазово-контрастный микроскоп. А, Б- увеличение х 1500, В - увеличение х 1 000

Установлено, что бактерии не образуют сероводород, не гидролизуют желатину, не восстанавливают нитрат до нитрита, не осуществляют процесс денитрификации. Для них характерен метаболизм дыхательного типа. Штамм БЗ-1 образует кислоту из сахарозы, глюкозы, инозита, маннита, сорбита, глицерина, образует фенилаланиндезаминазу. Штамм БЗ-5 гидролизует мочевину, образует кислоту из глюкозы, маннита, сорбита, глицерина. На основе физиологических и биохимических признаков исследуемые микроорганизмы могут быть отнесены к роду Deleya (Определитель бактерий Берджи, 1997).

Грамотрицательный штамм БЗ-4 растет при концентрации 8% NaCl в культуральной среде (таблица). Штамм образует округлые, блестящие, гладкие, с ровным краем колонии бежевого цвета. Клетки представляют собой каталазо-, фосфатазо-и оксидазоположительные, изогнутые, подвижные палочки. Штамм утилизирует ограниченное количество углеводов. На основе вышеперечисленных признаков штамм предварительно отнесен к роду Aquaspirillum. Изолированный нами штамм представляет интерес, так как для рода Aquaspirillum не описаны представители, способные расти при концентрации выше 3% NaCl в среде культивирования (Определитель бактерий Берджи, 1997).

Грамположительная культура БЗ-2 образует округлые, выпуклые, с ровным краем, белые, желтеющие на свету колонии. Клетки каталазоположительные, оксидазоотрицательные, неспорули-рующие палочки неправильной формы, на стационарной фазе преобладают кокки. Метаболизм дыхательного типа. Денитрификацию, восстановление нитрата до нитрита не осуществляет. Гидролизует желатину и крахмал. В клеточной стенке ми-коловые кислоты не обнаружены. Штамм определен как Arthrobacter sp.

Грамположительная культура БЗ-З образует округлые, выпуклые, светло-зеленые колонии. Клетки каталазоположительные, оксидазоотрицательные, не образующие споры подвижные палочки. Метаболизм дыхательного типа. Денитрификацию, восстановление нитратов до нитритов, гидролиз желатины и крахмала не осуществляет. В клеточной стенке нет миколовых кислот. Штамм предварительно идентифицирован как Microbacterium sp.                       .

Характеристика роста микробного сообщества и индивидуальных штаммов в присутствии различных концентраций NaCl

Нами установлено, что лишь два штамма (Rhodococcus sp. БЗ-7 и БЗ-8) из микробного сообщества способны к росту на нафталине как единственном источнике углерода и энергии. Штаммы используют нафталин в качестве субстрата в отсутствии и в присутствии хлорида натрия: штамм БЗ-7 - до 7.5 %, штамм БЗ-8 - до 9 % (таблица). Сопутствующие бактериальные штаммы (БЗ-1, БЗ-2, БЗ-З, БЗ-4, БЗ-5) способны утилизировать ацетат.

Изучено влияние разных концентраций (от 3 до 7.5%) NaCl на характер роста микробного сообщества БЗ и штамма-деструктора Rhodococcus sp. БЗ-7 (рис. 2, 3).

При росте СМБ-3 в среде с нафталином в качестве ростового субстрата максимальные значения оптической плотности наблюдались при культивировании в присутствии 3% NaCl и при отсутствии в среде соли (0.489 и 0.495, соответственно). Повышение концентрации хлорида натрия в среде культивирования до 6% и 7.5% приводило к увеличению продолжительности /ag-периода и снижению оптической плотности (рис. 2).

Рис. 2. Динамика роста микробного сообщества БЗ в минеральной среде Раймонда с нафталином при разных концентрациях NaCl: 7 - без соли, 2-3%, 3-6%, 4-7.5%

При культивировании бактериального штамма Rhodococcus sp. БЗ-7 в среде с нафталином в при сутствии разных концентраций соли наиболее высокое значение оптической плотности было зафиксировано при 3% NaCl, при этом отмечено отсутствие /ag-фазы. Этот факт можно объяснить тем, что инокулятом служила культура штамма БЗ-7, выращенная в минеральной среде Раймонда с содержанием NaCl 3%. В то же время описаны штаммы рода Rhodococcus, для которых концентрация 1-2% хлорида натрия оказывала стимулирующий эффект на рост (Плакунов и др., 1999). При увеличении концентрации хлористого натрия в среде до 6%, а также в отсутствии соли наблюдалось снижение оптической плотности культуры и увеличение продолжительности /ag-периода. Изменение оптической плотности штамма-деструктора при культивировании в присутствии 7.5% NaCl было незначительным (рис. 3).

Рис. 3. Динамика роста Rhodococcus sp. БЗ-7 в минеральной среде Раймонда с нафталином при разных концентрациях NaCl: 7 - без соли, 2 - 3%, 3-6%, 4-7.5%

В опытах по подсчету колониеобразующих единиц исследован характер роста штамма-деструктора при культивировании в микробном сообществе и индивидуальной культуре. Наиболее высокое значение количества клеток штамма-деструктора зафиксировано в присутствии 3% NaCl (рис. 4). В отсутствии соли отмечено снижение значения КОЕ/мл. При культивировании сообщества и индивидуальной культуры штамма-деструктора БЗ-7 при 7.5% хлорида натрия наблюдалось значительное различие в значении КОЕ/мл: при культивировании штамма БЗ-7 в сообществе КОЕ/мл было на два порядка выше, чем при росте в индивидуальной культуре (рис. 4).

Нами было исследовано влияние минерализации среды на качественный состав сообщества микроорганизмов БЗ. Установлено, что в присутствии 3% и 6% соли в среде культивирования сохраняется состав СМБ-3 (7 штаммов). В отсутствии соли элиминируется штамм БЗ-1, а другой штамм БЗ-5 лишь незначительно увеличивает значение КОЕ/мл. В присутствии 7.5% NaCl из сообщества элиминируется штамм БЗ-4 (рис. 5).

КОЕ/мл

1,00Е+10

1,00Е+09 -

Б

1,00Е+08 п

1,00Е+07

1,00Е+06 -|

1.00Е+05

без соли

Рис. 4. Максимальное количество клеток штамма Rhodococcus sp. БЗ-7 при культивировании в минеральной среде Раймонда с нафталином при разных концентрациях NaCl: А - индивидуальная культура, Б - клетки штамма в составе микробного сообщества

КОЕ/мл

1,00Е+11 -

1.00Е+05

А

1,00Е+07

1,00Е+06

1,00Е+10 -j

1.00Е+09 J

1,00Е+08

БЗ-1 БЗ-2 БЗ-З БЗ-4 БЗ-5 БЗ-7 БЗ-8

Рис. 5. Максимальное количество клеток штаммов при росте в составе микробного сообщества в минеральной среде Раймонда на нафталине при разных концентрациях NaCl: А - без соли, Б - 3%, 5-7.5%.

Заключение

Микробная ассоциация БЗ, выделенная из района солеразработок, включает в свой состав два штамма-деструктора рода Rhodococcus-. умеренно галофильный (Кашнер, 1981) штамм БЗ-1 и экстремально галотолерантный (Кашнер, 1981) штамм БЗ-5, предварительно отнесенные к роду Deleya. Кроме того, из сообщества изолированы еще три галотолерантные бактериальные культуры, способные утилизировать ацетат. Установлено, что штамм-деструктор Rhodococcus sp. БЗ-7 растет менее эффективно на нафталине в присутствии 7.5% хлорида натрия, чем при культивировании в сообществе. Можно предположить, что бактерии-деструкторы в процессе разложения нафталина выделяют в культуральную среду метаболиты (например ацетат), которые используются в качестве субстратов сопутствующими бактериями. В свою очередь галофильные и галотолерантные микроорганизмы могут выделять в среду культивирования осмопротекторные соединения, которые обеспечивают осмотический баланс клетки. К таким соединениям относятся аминокислоты и их производные, сахара и многоатомные спирты (Ventosa, 1998). Упомянутые органические вещества могут поглощаться штаммами-деструкторами, что обусловливает их способность эффективно расти и осуществлять разложение нафталина в условиях высокой минерализации среды.

Работа поддержана грантом РФФИ-Урал № 04-04-96042.