Изучение соотношения субпопуляций лимфоцитов в капиллярной крови папулы и в венозной крови при псориазе

(26).03.31-36

Sherstennikova AK, Kashutin SL, Neklyudova VS, Kalmin OV, Nikolaev VI. The study of the ratio of subpopulations of lymphocytes in the capillary blood of the papule and in the venous blood in patients with the psoriasis. Morfologicheskie Vedomosti – Morphological Newsletter. 2018 Oct 31;26(3):31-36. (26).03.31-36 .

Введение. К функциям молекул адгезии относится регуляция миграции и расселения иммунокомпетентных клеток в периферических органах, процесса специфического хоминга в лимфоидные органы, участие в клеточном взаимодействии при развитии иммунного ответа [1-2]. Как известно, реализация процессов миграции связана с L-селектинами, интегринами и молекулами суперсемейства иммуноглобулинов. На первом этапе непрочной адгезии в процесс адгезии вступают селектины, в том числе L-селектины, экспрессируемые на лимфоцитах, однако это не обеспечивает миграцию клеток через эндотелий [3]. Преодоление эндотелиального барьера осуществляется после наступления прочной адгезии при участии двух других групп адгезинов: интегринов и членов суперсемейства иммуноглобулинов [4]. На лимфоцитах экспрессируются такие важные для преодоления эндотелиального барьера интегрины, как LFA-1, LFA-3, взаимодействующие с членами суперсемейства иммуноглобулинов, представленными на эндотелиальных клетках: ICAM-1, ICAM-2 и VCAM-1 [5]. После фазы прочной адгезии следует собственно миграция лимфоцитов через эндотелий, связанная с экспрессией молекул PECAM [6]. Если миграция лимфоцитов в очаг воспаления исследована, то данные о миграции их в ткани в условиях отсутствия антигенной нагрузки, которой может быть инфекция, химическое или радиационное повреждение, стандартная иммунная нагрузка, единичны и разрозненны [7-9]. Нет количественных данных указывающих на уровень экспрессии молекул адгезии на лимфоцитах, в том числе в зависимости от размеров их цитоплазмы, поскольку данный критерий может указывать на уровень синтетической активности лимфоцитов и активность бласттрансформации [10-11]. Кроме того, представляет интерес изучение соотношения уровня экспрессии молекул L-селектина с уровнем экспрессии молекул фазы прочной адгезии: LFA-1, LFA-3 и ICAM-1. Таким образом, понимание процессов миграции различных морфологических популяций лимфоцитов, а также условий, при которых может активизироваться или замедляться данная миграция, является особенно важной для интерпретации резервов стабильности и сохранения гомеостаза.

Цель исследования – изучение соотношения содержания субпопуляций лимфоцитов капиллярной крови папулы и венозной крови в зависимости от их размеров и экспрессии поверхностных маркеров у пациентов с псориазом.

Материалы и методы исследования. Проведено клинико-иммунологическое обследование 82 пациентов (39 женщин и 43 мужчин) в возрасте от 20 до 60 лет, страдающих вульгарным и экссудативным псориазом в прогрессирующей и стационарной стадиях. Давность заболевания составила от 3 месяцев до 10 лет. В качестве контрольной группы обследованы 50 практически здоровых лиц (28 женщин и 22 мужчины) в возрасте от 20 до 60 лет, не имеющих на момент обследования острых хронических заболеваний или их обострения. Обследование проводили с письменного согласия респондентов, с соблюдением основных норм биомедицинской этики в соответствии с документом «Этические принципы проведения медицинских исследований с участием людей в качестве субъектов исследования» (Хельсинкская декларация Всемирной медицинской ассоциации 1964 года с изменениями и дополнениями на 2008 год). На мазках венозной крови и крови, полученной с поверхности псориатической папулы (феномен точечного кровотечения при проведении псориатической триады), зафиксированных в смеси Никифорова и окрашенных по Романовскому-Гимза, определяли концентрацию лимфоцитов среди других лейкоцитов: эозинофилов, базофилов, нейтрофилов, моноцитов. При изучении лимфоцитограммы дифференцировали лимфоциты по величине клетки с учетом размеров цитоплазмы: малые лимфоциты – до 8 мкм, средние – от 8 до 12 мкм, большие – больше 12 мкм [10]. Венозную кровь для исследования брали утром натощак. На проточном цитометре FC-500 “Beckman Coulter”, (США) определяли содержание L-селектина (CD62L, FITC), LFA-1 (CD11a, FITC), LFA-3 (CD58, FITC), ICAM-1 (CD54, FITC), PECAM-1 (CD31, FITC) на моноцитах цельной крови. Статистическую обработку результатов проводили с помощью SPSS 13.0 for Windows. Распределение параметров было ненормальным, в связи с чем описание выборок проводили с помощью подсчета медианы ( Мe ) и межквартильного интервала (25 и 75 процентили). Вероятность различий оценивали по непараметрическом критериям Колмогорова– Смирнова (Z) и Вилкоксона (W). Корреляционный анализ проведен с использованием коэффициента корреляции Спирмена ( ρ ).

Результаты исследования и обсуждение. Содержание лимфоцитов венозной крови как у пациентов с псориазом, так и в группе контроля было одинаковым (34,0% (28,0;43,0) и 37,0% (29,5;43,0); Z=0,75; р=0,62). Изменения касались структуры лимфоцитограммы (рис. 1). Так, у пациентов с псориазом регистрировали статистически значимое снижение концентрации больших по размеру лимфоцитов (с 10,0% (5,0;16,5) до 2,0% (0,1;6,0); Z=2,39; р=0,001), содержание малых    лимфоцитов    имело

Рис. 1 . Лимфоцитограмма у практически здоровых и пациентов псориазом. По оси абсцисс – наименования субпопуляций лимфоцитов в зависимости от размеров; по оси ординат – абсолютное содержание лимфоцитов; ** – р≤0,01.

незначительную тенденцию к увеличению (с 26,0% (16,0;37,0) до 33,0% (23,0;50,0); Z=1,11; р=0,16), тогда как уровень средних по размеру цитоплазмы лимфоцитов как у пациентов с псориазом, так и в группе контроля было одинаковым (44,0%    (36,0;50,0) и 44,0%

(37,0;50,0); Z =0,41; p=0,99).

Таким образом, несмотря на то, что в целом содержание лимфоцитов в венозной крови у пациентов псориазом и контрольной группой было одинаковым, различия заключались в статистически значимом снижении концентрации больших лимфоцитов и тенденцией к увеличению содержания малых лимфоцитов в структуре лимфоцитограммы.

Сравнение концентрации лимфоцитов (табл. 1) и их популяции в капиллярной крови, выделяемой с поверхности псориатической папулы и венозной крови, показало отсутствие различий в содержании общего количества лимфоцитов (30,53% (26,83;45,22) и 34,0% (28,0;43,0); W=0,01; р=0,89), а также малых (32,77% (18,41;45,46) и 33,0 (23,0;50,0); W=-0,72; р=0,47) и средних (47,12% (36,75;58,87) и 44,0% (37,0;50,0); W=-1,41; р=0,15) лимфоцитов. Заметно нарастала концентрация больших лимфоцитов в капиллярной крови (с 2,0% (0,1;6,0) до 19,10% (10,75;25,3); W=-3,11; р=0,002). Итак, несмотря на отсутствие видимых различий в содержании лимфоцитов венозной крови у пациентов псориазом изменения все же были, и они заключались в статистически значимом снижении концентрации больших лимфоцитов в структуре лимфоцитограммы. В капиллярной крови псориатической папулы содержание больших лимфоцитов нарастало. Учитывая, что процессы миграции клеток, в том числе и лимфоцитов, связаны с молекулами адгезии нами было изучено содержание лимфоцитов венозной крови имеющих молекулы адгезии.

Таблица 1 Соотношение содержания гематологических показателей в крови и папуле пациентов с псориазом (Mе (С25; С75))

Показатели, %	Венозная кровь практ. здоровых n= 50	Венозная кровь пациентов псориазом n= 82	Кровь с поверхности папулы n= 82	Уровень значимости различий (р)
Лимфоциты	37,0 (29,5; 43,0)	34,0 (28,0; 43,0)	30,53 (26,83;45,22)	Z=0,75; р=0,62 W=0,01; р=0,89
Малые лимфоциты	26,0 (16,0; 37,0)	33,0 (23,0; 50,0)	32,77 (18,41;45,46)	Z=1,11; р=0,16 W=-0,72; р=0,47
Средние лимфоциты	44,0 (36,0; 50,0)	44,0 (37,0; 50,0)	47,12 (36,75;58,87)	Z =0,41; p=0,99 W=-1,41; р=0,15
Большие лимфоциты	10,0 (5,0; 16,5)	2,0 (0,1; 6,0)	19,10 (10,75;25,3)	Z=2,39; р=0,001 W=-3,11; р=0,002

В соответствии с полученными данными различий в концентрации лимфоцитов, несущих молекулы L-селектина, между изучаемыми группами в зависимости от пола не выявлено (табл. 2). Статистически значимых различий не выявлено также в отношении содержания лимфоцитов, имеющих молекулы ICAM-1, LFA-1, LFA-3 и PECAM-1.

Таблица 2

Содержание лимфоцитов, экспрессирующих молекулы адгезии, у практически здоровых лиц и пациентов псориазом в зависимости от пола (Mе (С25; С75)) %

Показатели	Практически здоровые мужчины n=22	Практически здоровые женщины n= 28	Пациенты псориазом мужчины n=43	Пациенты псориазом женщины n=39	Уровень значимости различий (р)
L-селектин (CD62L)	9,9 (4,9; 17,5)	15,3 (3,0; 27,0)	13,8 (6,0; 30,6)	4,5 (1,1; 19,2)	2-3 Z=0,96; p=0,3 2-4 Z=0,81; p=0,51 3-5 Z=1,24; p=0,09 4-5 Z=1,19; p=0,11
LFA-1 (CD11a)	65,6 (45,9; 78,7)	69,7 (42,1; 77,1)	65,8 (46,3; 79,5)	63,5 (4,9; 80,79)	2-3 Z=0,53; p=0,93 2-4 Z=0,46; p=0,98 3-5 Z=0,89; p=0,39 4-5 Z=0,98; p=0,29
ICAM-1 (CD54)	9,4 (1,1; 21,3)	11,7 (4,6; 25,7)	24,7 (8,4; 41,5)	10,2 (1,4; 32,7)	2-3 Z=0,74; p=0,64 2-4 Z=1,34; p=0,05 3-5 Z=1,04; p=0,22 4-5 Z=1,25; p=0,08
LFA-3 (CD58)	63,0 (15,4; 82,7)	19,9 (9,6; 83,0)	64,1 (32,0; 84,6)	19,2 (6,2; 64,2)	2-3 Z=0,55; p=0,92 2-4 Z=0,56; p=0,91 3-5 Z=0,70; p=0,70 4-5 Z=1,67; p=0,007
PECAM-1 (CD31)	12,1 (3,2; 20,2)	14,2 (3,9; 29,8)	8,5 (4,4; 16,4)	7,0 (0,9; 15,4)	2-3 Z=0,73; p=0,64 2-4 Z=0,58; p=0,88 3-5 Z=1,20; p=0,11 4-5 Z=0,93; p=0,35

Корреляционный анализ на этапе «роллинга» у пациентов псориазом показал отсутствие достоверных корреляций между содержанием лимфоцитов с рецепторами к L-селектину и концентрацией малых, средних и больших лимфоцитов, тогда как в группе сравнения между концентрациями средних по размеру лимфоцитов и лимфоцитами с рецепторами к L-селектину выявлена статистически достоверная корреляция ( ρ =0,35; р=0,01) (рис. 2). На этапе «прочной адгезии»

количество лимфоцитов с рецепторами к LFA-1 коррелировало с концентрацией средних лимфоцитов как у пациентов псориазом ( ^ =0,50; р=0,001), так и у здоровых лиц ( ^ =0,57; р=0,001). Различие состояло в том, что у пациентов псориазом была отмечена корреляция с большими лимфоцитами ( ρ =0,41; р=0,003) и не было, как в группе сравнения, корреляций с концентрацией малых лимфоцитов (рис. 3). Существенные различия были отмечены в отношении лимфоцитов, экспрессирующих рецепторы к ICAM-1: у пациентов псориазом в отличие от контрольной группы регистрировались статистически достоверные корреляции с содержанием средних ( ρ =0,29; р=0,013) и больших лимфоцитов ( ρ =0,39; р=0,005)

Рис. 2. Корреляция между содержанием молекул адгезии L-селектина (CD62L) на лимфоцитах и размером их цитоплазмы (малые, средние и большие). В скобках указаны корреляционные значения по Спирмену и значимость коэффициента корреляции: * - p<0,05 и ** - p<0,01.

Рис. 3. Корреляция между содержанием молекул адгезии LFA-1 (CD11a) на лимфоцитах и размером их цитоплазмы (малые, средние и большие). Условные обозначения: слабая связь - стрелка штрихами; умеренная и сильная связь - стрелка линией. В скобках указаны корреляционные значения по Спирмену и значимость коэффициента корреляции: * - p<0,05 и ** -

Рис. 4. Корреляция между содержанием молекул адгезии ICAM-1 (CD54) на лимфоцитах и размером их цитоплазмы (малые, средние и большие). Условные обозначения: см. обозначения на рис. 3.

Между содержанием лимфоцитов с рецепторами LFA-3 выявлены корреляции с концентрациями средних лимфоцитов как у пациентов псориазом ( ρ =0,49; р=0,001), так и у здоровых лиц ( ρ =0,43; р=0,01). Различие состояло в том, что у пациентов псориазом была отмечена корреляция с большими лимфоцитами ( ρ =0,59; р=0,001), которой не было в группе сравнения (рис. 5).

большие (-0,09)

Рис. 5. Корреляция между содержанием молекул адгезии LFA-3 (CD58) на лимфоцитах и размером их цитоплазмы (малые, средние и большие). Условные обозначения: слабая связь – стрелка штрихами; умеренная и сильная связь – стрелка

Пациенты

средние (0,49**)

–

сплошной линией. В скобках указаны корреляционные значения по Спирмену и значимость коэффициента корреляции * p<0,05 и ** – p<0,01.

Рис. 6. Корреляция между содержанием молекул адгезии PECAM-1 (CD31) на лимфоцитах и размером их цитоплазмы (малые, средние и большие). Условные обозначения: см. обозначения на рис 5.

Пациенты средние

большие

<0,47**)

На этапе «трансмиграции» у пациентов с псориазом выявлены статистически достоверные корреляции между уровнем лимфоцитов с рецепторами к PECAM-1 и концентрациями средних ( ρ =0,34; р=0,01) и больших лимфоцитов ( ρ =0,47; р=0,001). В группе сравнения статистически значимых корреляций не выявлено (рис. 6). Итак, в условиях гиперпролиферации кератиноцитов, что и наблюдается при псориазе, содержание малых лимфоцитов не изменялось. Не было и статистически достоверных корреляций между концентрациями малых лимфоцитов и лимфоцитов, экспрессирующих рецепторы к L-селектину, LFA-1, ICAM-1, LFA-3 и PECAM-1. В связи с этим можно предполагать об отсутствии существенной роли малых лимфоцитов в патогенезе гиперпролиферации кератиноцитов при псориазе. Изменений в концентрации средних лимфоцитов у пациентов с псориазом не зарегистрировали. Корреляции между содержаниями средних лимфоцитов и лимфоцитами, экспрессирующими рецепторы к LFA-1 и LFA-3, наблюдали как у пациентов с псориазом, так и в группе сравнения. Отличием являлось то, что в условиях гиперпролиферации кератиноцитов отмечены статистически достоверные корреляции между уровнями средних лимфоцитов и лимфоцитов с рецепторами к ICAM-1 и PECAM-1.

Заключение. Таким образом, у пациентов с псориазом наибольшие изменения касались содержания в венозной крови больших лимфоцитов, уровень которых существенно был снижен, тогда как в псориатической папуле, наоборот, резко повышен. Как известно, большие лимфоциты являются свидетельством лимфопролиферации [5]. Складывается впечатление, что в условиях гиперпролиферации кератиноцитов увеличивается миграция именно больших, но не средних и, тем более, малых лимфоцитов. В пользу увеличения миграционной активности больших лимфоцитов может указывать тот факт, что воспалительный процесс сопровождается лимфопролиферацией и псориаз в этом смысле не является исключением [7, 11]. С другой стороны, наличие статистически достоверных корреляций между концентрациями больших лимфоцитов и лимфоцитов, экспрессирующих рецепторы к LFA-1, ICAM-1, LFA-3 и PECAM-1 при отсутствии таковых корреляций в группе сравнения может дополнительно указывать на преимущественную миграцию лимфоцитов вступивших в лимфопролиферацию.