Изучение способности алканотрофных родококков к биотрансформации стигмаст-5-ен-зр-ола

В работе использовали 99 штаммов родококков (табл. 1), принадлежащих видам R. erythropolis, R “longus", R. opacus, R. rhodochrous, R. ruber и хранящихся в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ (Каталог штаммов..., 1994; www.ecology. .

Таблица 1

Коллекционные штаммы Rhodococcus spp.

Род, вид	Количество штаммов	Номер штамма в коллекции ИЭГМ
R. erythropolis	18	10,12,22,23,179,183,188, 192,200,203, 252,259,267, 271,487,498,505,696
R. "longus "	4	28,32, 68,69
R. opacus	3	246, 261,489
R. rhodochrous	3	64, 647, 655
R. ruber	71	71, 72,73, 74, 75, 76, 77,78, 79, 80,81, 82,83, 84, 85,86, 87,88, 89,90,91,92, 93,94, 172,219,220,221,223,224, 225,226,227,228,230,231, 232,233,234,235,236,237, 238,239,240,241,242,243, 320,321,322,323,324,325, 326,327,328,329,331,333, 346,381, 457,467,468,474, 478, 577, 583,593,597

Культуры выращивали в жидкой минеральной среде (г/л): KNO3- 1,0; КН2РО4 - 1,0; К2НРО4 -1,0; NaCl - 1,0; MgSO4- 0,2; СаС12-0,02; FeCl3 -0,001; дрожжевой экстракт - 0,1, содержащей 0,1 об.% н-гексадекана, 1,0 % глицерина или 1,0 % глюкозы. Стигмаст-5-ен-Зр-ол (500мг/л) предварительно растворяли в пропан-2-оле и добавляли в минеральную среду через 48 ч культивирования бактериальных клеток. В экспериментах по ингибированию 9а-гидроксилазной активности одновременно с стигмаст-5-ен-ЗР-олом в качестве ингибитора вносили 2,2'-дипиридил (70 мг/л). Культивирование родококков проводили на орбитальном шейкере (150 об/мин) при температуре 28°С. Посевным материалом служили родококки (5 х 105кл/мл), выращенные на мясопептонном агаре и отобранные в экспоненциальной фазе роста. Содержание белка определяли с использованием модифицированнового метода Лоури (Горина, Яковлева, 1980). Количество остаточного стерина в культуральной жидкости выявляли ферментативным экспресс-методом (Allain et al., 1974) с использованием спектрофотометра Lambda EZ201 (Perkin Elmer) и коммерческой тест-системы контроля уровня холестерола (ООО «Ольвекс Диагно-стикум», Санкт-Петербург).

Продукты микробного окисления экстрагировали этиловым эфиром уксусной кислоты (3 х 50

мл). Объединенные этилацетатные вытяжки сушили над обезвоженным сульфатом натрия. Растворитель удаляли с помощью роторного испарителя. Образование продуктов бактериального окисления контролировали методом тонкослойной хроматографии на Sigma-Aldrich ТСХ пластинах. Образование стигмаст-4-ен-З-она регистрировали в УФ-лучах, остальных интермедиатов — опрыскиванием H2SO4 (конц.) и последующим прогреванием при 95-100°С в течение 4-6 мин. При анализе реакционных смесей в качестве эталонного соединения использовали химически чистый стигмаст-4-ен-З-он, который получали путем окисления стигмаст-5-ен-Зр-ола хромовой смесью. Количественный состав продуктов окисления анализировали с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии на приборе Милихром (колонка 6,3x0,2 см с фазой Lichrosorb RP-18). В качестве элюента использовали метанол, дегазированный путем продувки гелия, в качестве растворителя для нанесения пробы на колонку — смесь ацетона с метанолом (3:1); рабочая длина волны прибора - 210 нм. Содержание стигмаст-4-ен-З-она в сумме стерино-вых компонентов определяли по площадям пиков хроматограмм реакционных смесей с учетом коэффициентов, обусловленных разницей в экстинкции исходного и конечного продукта. Данные коэффициенты рассчитывали при использовании искусственных смесей стигмаст-5-ен-ЗР-ола и стиг-маст-4-ен-З-она. Качественный анализ продуктов биотрансформации проводили на газовом хроматографе Agilent 6890N с квадрупольным масс-спектрометром Agilent MSD 5973N в качестве детектора и кварцевой колонкой HP-5MS SN US 15189741-1.

Для статистической обработки результатов использовали компьютерные программы Microsoft Excel.

Результаты и их обсуждение

Экспериментами установлено, что все исследуемые штаммы родококков используют стигмаст-5-ен-ЗР-ол в качестве единственного источника углерода и энергии. При этом уровень деструкции исходного субстрата незначителен и не превышает 20%.

Нами был отобран штамм R ruber ИЭГМ 233 (табл. 2), трансформирующий стигмаст-5-ен-Зр-ол до стигмаст-4-ен-З-она (7,9%), образование которого катализируется бифункциональным ферментом - холе-стеролоксидазой, ответственным за реакции окисления ЗР-гидроксильной группы и изомеризации двойной связи. С целью повышения степени конверсии стерина данный штамм выращивали в соокислитель-ных условиях с использованием глицерина, глюкозы или н-гексадекана. По нашим данным, максимальное (68,59 мкг/мл) накопление клеточного белка наблюдается при выращивании R. ruber ИЭГМ 233 в условиях соокисления с глюкозой, в остальных слу- чаях содержание белка не превышает 20,83-27,95 мкг/мл (рис. 2).

Таблица 2

Биотрансформация стигмаст-5-ен-Зр-ола клетками Rhodococcus spp.

Вид, штамм	Сумма продук-тов реакции, мг/л 460,70	Содержание в сумме продуктов реакции, мг/л
		Стигмаст- 5-ен-Зр-ол 460,70	Стигмаст- 4-ен-З-он Не обнаружено
Абиотический контроль
R. erythropolis ИЭГМ 22	443,42	421,64	(<1)
R. erythropolis ИЭГМ 23	468,12	461,45	(<1)
R. erythropolis ИЭГМ 179	441,52	415,83	15,69(3,6)
R erythropolis ИЭГМ 183	439,21	411,18	17,45 (4,0)
R. ruber ИЭГМ 77	428,63	397,62	9,08(2,1)
R. ruber ИЭГМ 80	451,28	449,43	(<1)
R. ruber ИЭГМ 233	365,57	308,83	28,84 (7,9)
R. ruber ИЭГМ 322	450,27	443,87	(<1)

Примечание. Здесь и в табл. 3 в скобках приведено количество стигмаст-4-ен-З-она в процентах.

Как видно из табл. 3, родококки осуществляют биотрансформацию стигмаст-5-ен-ЗР-ола наиболее активно в условиях соокислительного роста в присутствии н-гексадекана. При этом в качестве основного

Рис. 2. Содержание клеточного белка R. ruber ИЭГМ 233 при росте в среде с стигмаст-5-ен-ЗР-олом в присутствии:

1 - глюкозы, 2 - н-гексадекана, 3 - глицерина продукта биотрансформации накапливается значительное (310,5 мг/л) количество стигмаст-4-ен-З-она -общая сумма продуктов реакции составляет 376,65 мг/л. В связи с этим все эксперименты по изучению трансформирующей активности родококков в дальнейшем проводили в соокислительных условиях с ис пользованием и-гексадекана. На рис. 3 представлены хроматограммы продуктов биотрансформации стери-на клетками Rhodococcus spp., полученные с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии. Большинство исследуемых штаммов родококков в условиях соокисления с и-гексадеканом трансформируют стигмаст-5-ен-ЗР-ол до стигмаст-4-ен-3-она, содержание которого в сумме продуктов биотрансформации у наиболее активных бактериальных культур составляет от 40,0 до 98,0%. Как видно из табл. 4, представители R ruber характеризуются наиболее выраженной холестеролоксидазной активностью в отношении стигмаст-5-ен-Зр-ола и катализируют процесс биоконверсии стерина до образования стигмаст-4-ен-З-она.

Таблица 3

Биотрансформация стигмаст-5-ен-Зр-ола клетками Rhodococcus ruber ИЭГМ 233

Источник углерода	Сумма продуктов реакции, мг/л	Содержание в сумме продуктов реакции, мг/л
		Стигмаст- 5-ен-ЗР-ол 308,83	Стигмаст-4-ен-З-он
Р-Сигостерол	365,57		28,84 (7,9)
ч-Гексадекан	376,65	10,75	310,50 (82,4)
Глицерин	248,23	167,47	60,35 (24,3)
Глюкоза	152,42	59,44	83,25 (54,6)

Таблица 4

Биотрансформация стигмаст-5-ен-Зр-ола клетками Rhodococcus spp. в присутствии н-гексадекана

Вид, штамм (число штаммов) Абиотический контроль	Количество стигмаст-4- ен-3-она, % 0
R. erythropolis (7)	4,7-27,1
R. erythropolis (10)	41,0-57,1
R. erythropolis ИЭГМ 10	70,7
R. "longus" (4)	2,2-8,0
R. opacus (3)	2,9-6,3
R. rhodochrous (3)	0-14,4
R. ruber (27)	4,6-27,4
R. ruber(13)	33,9-47,3
R ruber (22)	51,2-78,4
R. ruber ИЭГМ 219	80,0
R. ruber ИЭГМ 233	82,4
R. ruber ИЭГМ 235	90,6
R. ruber ИЭГМ 94	92,7
R. ruber ИЭГМ 72, ИЭГМ 85, ИЭГМ 86, ИЭГМ 172, ИЭГМ 220	98,0

Необходимо отметить, что во всех экспериментах был получен низкий уровень продуктов отщепления боковой цепи Р-ситостерола, содержание которых не превышало 2%. С учетом результатов определения способности родококков к более полной деградации стигмаст-5-ен-ЗР-ола (табл. 3) и максимального накопления клеточной биомассы в условиях соокисления с глюкозой (рис. 2)

R. erythropolis ИЭГМ 203 R. ruber ИЭГМ 80 К ruber ИЭГМ 91

Рис. 3. Хроматограммы продуктов биотрансформации стигмаст-5-ен-З 0-ола клетками Rhodococcus spp. в соокислительных условиях в присутствии и-гексадекана:

1 - остаточный стигмаст-5-ен-ЗР-ол; 2 - стигмаст-4-ен-З-он последующие скрининговые исследования проводили в условиях ингибирования активности фермента 9а-гидроксилазы, катализирующего начальную стадию деструкции циклического остова молекулы стерина. По данным хромато-масс-спект-рометрии, в присутствии глюкозы и ингибитора 2,2'-дипиридила с использованием клеток родококков достигается отщепление боковой алифатической цепи стигмаст-5-ен-30-ола с образованием 10% 170-гидроксиандроста-4-ен-3-она (тестостерона). Необходимо отметить, что в литературе описана способность лишь некоторых прокариотных организмов, в частности микобактерий, к одностадийной трансформации стеринов до образования тестостерона (Hung et al, 1994; Lo et al., 2002).

17р-Г идроксиандрост-4-ен-З-он (тестостерон)

Таким образом, нами установлено, что большинство исследованных коллекционных штаммов

Rhodococcus spp. в соокислительных условиях с н-гексадеканом трансформирует стигмаст-5-ен-30-ол в стигмаст-4-ен-З-он. При этом представители R. ruber характеризуются выраженной холестеро-локсидазной активностью по отношению к исходному стерину. Обнаружено, что родококки в соокислительных условиях с глюкозой в присутствии ингибитора 2,2’-дипиридила катализируют реакцию отщепления боковой алифатической цепи 0-ситостерола с образованием целевого продукта 170-гидроксиандроста-4-ен-3-она (тестостерона).

Работа поддержана грантами ФЦП «Интеграция науки и высшего образования России на 20022006 годы» (проект № И0573/1343), РФФИ (№ 0104-96461).