Изучение структуры генофондной популяции русской белой породы кур методом геномного SNP-сканирования

Современные методы не находят заметного применения при углубленном изучении отечественного генофонда домашних кур. Вместе с тем сохранение и использование полезных качеств их непромышленных пород остаются важной научной и экономической задачей. Генофондная птица может использоваться в биотехнологии, служить моделью для изучения

* Исследования проведены при поддержке Российского научного фонда (грант ¹ 16-16-04060). Образцы крови получены из «Генетической коллекции редких и исчезающих пород кур» ВНИИРГЖ в рамках программы Федерального агентства научных организаций по поддержке биоресурсных коллекций.

биологических процессов и поиска ассоциаций генов (генетических маркеров) с хозяйственно полезными признаками (1-4).

Порода русских белых кур яичного направления продуктивности с белой окраской оперения разводится в генофондном хозяйстве Всероссийского НИИ генетики и разведения сельскохозяйственных животных (ВНИ-ИГРЖ) с 1953 года и изначально имела линейную структуру (1). Две линии (¹ 10 и ¹ 16) различались между собой по адаптационным способностям в условиях пониженной температуры выращивания в ранний постнатальный период (1). Еще одна опытная группа этой породы характеризовалась белым цветом эмбрионального пуха, и вся популяция на протяжении 25 поколений выращивалась при пониженных температурах (1). При разведении русских белых кур применяли индивидуальный подбор. До 2002 года популяция воспроизводилась внутри линий ¹ 10 и ¹ 16, а затем до 2012 года ее содержали при общепринятой температуре и разводили методом панмиксии, в результате чего линейная структура породы была утрачена. На основе сохранившегося поголовья была сформирована новая популяция русских белых кур, особенности которой — белый цвет пуха в 1-суточном возрасте и способность цыплят в первые дни жизни адаптироваться к пониженным температурам (22-23 ° С) в сравнении с общепринятыми в этом возрасте (30-33 ° С). В настоящее время содержание при пониженных температурах не применяется (1).

Совершенствование желательных качеств при разведении малочисленных популяций невозможно без оценки их популяционно-генетической структуры. Применение молекулярных маркеров (минисателлиты, микросателлиты) и другие методы изучения полиморфизма ДНК, широко использовавшиеся ранее (2-7), в последнее время уступают место использованию многочисленных однонуклеотидных маркеров (single nucleotide polymorphisms, SNP). Десятки и сотни тысяч SNP-маркеров позволяют генотипировать весь геном и связывать найденные вариации по этим маркерам с количественными признаками. SNP-сканирование — высокоэффективный инструмент генетического анализа, способный выявлять структурные особенности популяции, которые можно использовать в селекции (8-11). Сочетание молекулярно-генетических данных с математическими моделями повышает точность прогноза племенной ценности животных для селекции и эффективности управления генетической изменчивостью, что приводит к ускорению генетического прогресса в селекционируемых популяциях (12, 13). При разведении малочисленных популяций наблюдается рост частоты встречаемости протяженных участков гаплотипов (в том числе ROH, гомозиготных районов), достаточно стабильно передающихся из поколения в поколение (14-16), что ведет к снижению генетического разнообразия в малой популяции (17, 18).

Для оценки дифференциации изучаемых групп (популяций, пород) широко используется многомерное шкалирование (multidimensional scaling, MDS-анализ) (19). Разработаны методы, в основу которых положены предопределенная структура анализируемых групп и расчет генетического расстояния между особями с помощью алгоритма построения дерева, объединяющего их в кластеры (20). Созданы и применяются модели для разграничения кластеров на основе генотипов по десяткам тысяч локусов и с использованием байесовского подхода, которые, например в компьютерных программах STRUCTURE и ADMIXTURE, учитывают также наличие распределения Харди-Вайнберга и неравновесного сцепления (linkage disequilibrium, LD) (7, 21, 22).

С помощью полногеномного SNP-генотипирования нами впервые выявлена субпопуляционная структура современной породы кур русская 1167

белая из биоресурсной коллекции ВНИИРГЖ, которая располагает уникальным генетическим материалом отечественных и зарубежных пород, и установлены отличия изученных групп птицы от исходной популяции.

Нашей целью было показать возможности полногеномного SNP-сканирования для изучения генетических особенностей структуры популяции малочисленных пород кур отечественного происхождения и динамические изменения молекулярной архитектуры на примере сравнения современной популяции русской белой породы с популяцией 2001 года.

Методика. Материалом для исследования служила ДНК, выделенная из крови кур ( Gallus gallus ) русской белой породы, содержащихся в биоре-сурсной коллекции ВНИИРГЖ «Генетическая коллекция редких и исчезающих пород кур» (г. Санкт-Петербург—Пушкин). Были проанализированы две группы кур: популяция 2001 года (6 гол., неродственные особи из двух линий) и современная популяция (156 гол.). SNP-анализ включал скрининг 162 образцов ДНК с микрочипом Illumina Chicken 60K SNP iSelect BeadChip («Illumina», США). Качество генотипированных SNP-локусов контролировали с помощью программы PLINK 1.9 (23). Дополнительно для анализа отбирали образцы ДНК с качеством генотипирования по SNP-локусам более 90 %, что оценивалось с использованием программы GenomeStudio («Il-lumina», США). Были установлены лимиты по ошибкам Харди-Вайнберга — HWE (P ≤ 0,0001). SNP, находящиеся в неравновесном сцеплении (--indeppairwise 50 5 0,5) в программе PLINK 1.9, удаляли. Для устранения влияния пола на оценку были исключены SNP-маркеры, находящиеся на половых хромосомах. Генетическую структуру популяции выявляли с помощью MDS-анализа в программе PLINK 1.9. Частоту встречаемости аллеей и неравновесное сцепление по группам также рассчитывали с помощью PLINK 1.9.

Многофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) проводили в программе RStudio (24). Достоверность влияния группы, хромосомы, их взаимодействия и SNP-интервала (п.н.) на LD оценивали с помощью линейной модели (10): r² _i j = μ + BL _i + Gga j + (BL ½ Gga) _i j + bSNP _int + e _ik , где r² _i j — парное значение LD, μ — общее среднее значение LD, BL _i — эффект i -й группы, Gga j — эффект j -й хромосомы курицы (с 1-й по 28-ю хромосому), SNP_int — эффект интервала между SNP-маркерами, который определялся как расстояние между маркерами (число пар нуклеотидов), b — коэффициент регрессии.

Построение модели для разграничения кластеров на основе SNP-генотипов проводили в программе ADMIXTURE (25).

Результаты. В зависимости от распределения генотипированных особей популяцию условно разделили на MDS-группы и сравнивали с данными родословной и с представителями предковой популяции 2001 года. На плотность распределения точек на графике, полученном методом многомерного шкалирования (рис. 1), оказывало влияние наличие мономорфных и минорных аллелей с низкой частотой (MAF). Это усложняло оценку изменчивости по остальным маркерам. В предварительной работе по подбору параметров фильтрации MAF было выбрано ограничение 0,1, исключающее все мономорфные аллели и минорные с частотой ниже 10 %.

Условно всю современную популяцию можно было разделить на четыре кластера (MDS1-MDS4). Кластеры MDS1 и MDS2 оказались разделены по оси C2, MDS1, MDS2, MDS3 от MDS4 — по оси C1. В кластер MDS1 входили в основном особи, ведущие происхождение от петуха ¹ 99. Кластер MDS2 представляли потомки петухов ¹ 98 и ¹ 99 (табл. 1). Кластер MDS4 преимущественно составляла птица, родоначальником которой был петух ¹ 97. Кластер MDS3 объединял потомков петуха ¹ 58 и промежуточные варианты, близкие по происхождению матерей к другим кластерам.

1. Распределение потомков петухов по MDS-клас-         Из выделенных терам в современной популяции кур русской белой кластеров были сфор- породы (биоресурсная коллекция ВНИИРГЖ мированы группы осо- «Генетическая коллекция редких и исчезающих бей, у которых изучали пород кур», г. Санкт-Петербург—Пушкин)       генетические характе-
Петух- Петух-родо-отец, ¹ начальник, ¹	Кластер	ристики (табл. 2). Стру- Всего ктурные особенности
	MDS1 MDS2 MDS3 MDS4
981206         98         0     10      3     0    13     групп оценивали по на- 981205            98            0       16        0       1      17 981501        98        0     0     5     0    5    личию и протяженно- 991803         99         0     14      0     0    14     сти районов, где на- 991203            99           16        0        1       0      17 970905         97         0      0      0    12    12    блюдалось неравновес- 971103         97         0      0      0    16    16    ное сцепление SNP-ма- 970907            97            0        0        0      15      15 971601         97         0      0      0    13    13    ркеров. Максимальное 581706         58         0      0      9     0     9    среднее значение LD 481701         58         1      0      8     7    16    было обнаружено в по- 639                              0        0        9       0      9 Всего                   17     40     35    64   156 пуляции 2001 года. Ко личество мономорфных

Рис. 1. MDS-распределение генотипированных кур русской белой породы по четырем кластерам (MDS1-MDS4): о — особи современной популяции, ▲ — архивные образцы ДНК 2001 года; С1 — координата 1, С2 — координата 2 (б иоресурсная коллекция ВНИИРГЖ «Генетическая коллекция редких и исчезающих пород кур», г. Санкт-Петербург—Пушкин).

аллелей в этой группе также оказалось самым высоким. Группа MDS3 занимала центральную позицию вместе с популяцией 2001 года, но в отличие от нее имела минимальное число мономорфных SNP и существенное количество минорных аллелей с частотой встречаемости меньше 10 %. В группе 2001 года по всем хромосомам наблюдались максимальные показатели r2 и высокая частота (0,24) неравновесного сцепления, равного 1, при значительном расстоянии между SNP-маркерами (500-1000 т.п.н.). Среднее значение LD, рассчитанное по хромосомам, было высоким как в современной, так и в предковой популяции и колебалось от 0,150±0,006 до 0,587±0,006.

Дополнительный многофакторный дисперсионный анализ с использованием F-теста (табл. 3) показал достоверное (Р < 0,0001) влияние на LD (r2) группы, хромосомы, дистанции между SNP-маркерами и хромосомы в группе. Наибольшее влияние оказывала группа и дистанция между SNP-маркерами.

Одним из эффективных методов выявления различий между группами и породами животных считается кластерный анализ адмикс-моделей (25, 26). При кластеризации в программе ADMIXTURE была проведена оценка коэффициента кросс-проверки (CV) для определения оптимального числа K. Минимальная ошибка наблюдалась при K = 12 (рис. 2). Группы MDS1 и MDS2 имели однородную структуру и не различались при К = 2, частично различались при К = 3 и обнаруживали значительное различие при

К = 4 и К = 5. Группа MDS4 образовала генетически неоднородный кластер, отличающийся от MDS1 и MDS2 при К от 2 до 5. Группа MDS3 была более однородна и близка к популяции 2001 года при величине К от 2 до 5.

2. Характеристика предковой популяции (2001 год) и групп, сформированных на основе MDS-кластеров распределения особей современной генофондной популяции кур русской белой породы, по локусам SNP-маркеров (биоре-сурсная коллекция ВНИИРГЖ «Генетическая коллекция редких и исчезающих пород кур», г. Санкт-Петербург—Пушкин)

Показатель	Группа
	MDS1	MDS2	MDS3	MDS4	2001
Всего генотипировано SNP В том числе:	57636	57636	57636	57636	57636
локусов с высоким качеством генотипирования (> 0,90)	43224	43224	43224	43224	43224
локусов с мономорфными аллелями	9176	8157	1507	5393	19833
локусов с минорными аллелями (MAF ≤ 0,1)	5943	7800	10443	8200	3827
HWE (P ≤ 0,0001)	949	1021	1244	1543	0
LD ( M ±SEM) Частота LD = 1 при расстоянии между	0,272±0,001	0,241±0,001	0,193±0,001	0,197±0,001	0,506±0,001
SNP 500-1000 Кб	0,07	0,03	0,02	0,02	0,24

П р и м еч а ни е. MAF — частота минорных аллелей, HWE — число SNP, не прошедших тест на равновесие Харди-Вайнберга (при P ≤ 0,0001), LD — неравновесное сцепление, M — среднее значение LD, ±SEM — стандартная ошибка среднего.

3. Оценка эффекта MDS-группы, хромосомы и интервала между SNP-маркерами на неравновесие по сцеплению (r²) в популяции кур русской белой породы (биоресурсная коллекция ВНИИРГЖ «Генетическая коллекция редких и исчезающих пород кур», г. Санкт-Петербург—Пушкин)

Фактор	п DF	]       SS	1     MS	]       F	1 P
Группа	4	3244	811,0	11947,40	P < 0,001
Хромосома	27	178	6,6	96,93	P < 0,001
SNP-дистанция	1	244	243,8	3592,35	P < 0,001
Группа ½ хромосома	105	289	2,8	40,61	P < 0,001
Примечание. DF —	число степеней свободы, SS —		сумма квадратов,	MS — средняя	квадратов, F —
распределение Фишера.

Как известно, традиционный подход в селекции птицы при индивидуальном учете включает отбор по продуктивности родителей, собственной продуктивности и подбор неродственных пар. При панмиктическом разведении, имевшем место в случае современной популяции русских белых кур, сложно определить происхождение и генетическую изменчивость полученного потомства. Характеристика генетической изменчивости решает проблему определения структуры и оценивает динамические изменения молекулярной архитектуры в популяции.

В современной популяции русских белых кур как потомков популяции 2001 года мог происходить специфический дрейф генов. Отметим, что представители популяции 2001 года (2 особи линии ¹ 16 и 4 особи линии ¹ 10) локализовались в центральной области распределения одного и того же современного кластера MDS3 (см. рис. 1). Хотя число обследованных особей предковой популяции было невелико, данные их генотипирования можно принимать в расчет, поскольку значительное число SNP-маркеров, использованных в популяционном анализе, не требует для объективной оценки увеличения числа анализируемых особей (27-29). Неродственные особи разных линий были расположены очень близко друг от друга, так как обе линии вели происхождение от одного петуха.

Однако генотипы неродственных особей, участвовавших в анализе, видимо, не полностью отражают генетическое разнообразие породы в 2001 году. Не все минорные аллели популяции 2001 года при ограниченном наличии материала (6 гол.) оказались учтены. Возможно, некоторые мономорф-1170

ные аллели в популяции были минорными. В то же время при MDS-анализе минорные аллели (частично) и все мономорфные элиминировались при фильтрации MAF и не могли повлиять на распределение и, соответственно, выводы о генетической близости или удаленности особей и популяций. В предварительном анализе полное исключение минорных аллелей не влияло на картину разделения популяции на MDS-группы. Удаление SNP, находящихся в неравновесном сцеплении (--indep-pairwise 50 5 0,5), при варьировании условий отбора SNP не изменило расположения кластеров. Результаты наших исследований показали, что общность происхождения служит основным фактором, влияющим на относительное MDS-распределение.

Рис. 2. Популяционная изменчивость SNP-маркеров внутри русской белой породы кур, рассчитанная в программе ADMIXTURE: 1, 2, 3, 4 — кластеры MDS1, MDS2, MDS3 и MDS4 современной популяции, 5 — представители популяции 2001 года. К — выбранное число предковых популяций (биоресурсная коллекция ВНИИРГЖ «Генетическая коллекция редких и исчезающих пород кур», г. Санкт-Петербург—Пушкин).

Наличие уникальных гаплотипов — важная характеристика популяций (19, 29). Протяженность районов, где наблюдается неравновесное сцепление SNP-маркеров, считается основной структурной особенностью исследуемых групп (8). Большое количество маркеров, находящихся в неравновесном сцеплении, служило отличительной чертой предковой популяции русской белой породы, что отражалось на величине LD. Наличие у неродственных животных значительного количества SNP, находящихся в неравно- весном сцеплении на большом расстоянии друг от друга, свидетельствует скорее об ограниченном поголовье, которое было использовано в селекции. Это подтверждают другие исследования на промышленных линиях (8, 17). Современная популяция русских белых кур характеризуется распадом длинных LD районов и сокращением частоты гаплотипов предковой популяции.

Таким образом, неоднородность современной популяции русских белых кур из генофондного хозяйства Всероссийского НИИ генетики и разведения сельскохозяйственных животных обусловлена их происхождением от разных петухов-родоначальников. Обнаружена группа (MDS3), имеющая наибольшее сходство с предковой популяцией 2001 года. Особенность последней — значительное число мономорфных аллелей и высокая частота встречаемости длинных LD-районов. В современной популяции увеличилась частота минорных аллелей и уменьшились показатели LD. В целом SNP-сканирование позволяет выявлять структуру родственных связей в породе на основе генетического сходства индивидуумов, что особенно важно при панмиктическом разведении пород с ограниченным поголовьем. Сравнение современной популяции с предковой дает возможность проследить исторические изменения в молекулярной организации генома русской белой породы. Генофондные популяции, генетическая изменчивость которых формировалась в течение длительного времени, считаются ценным источником биоразнообразия. Характеристика их генетических особенностей актуальна для использования лучших качеств животных в селекции по хозяйственно полезным признакам. В настоящей работе получена важная информация о генетических особенностях малочисленной породы кур отечественного происхождения. Эти сведения в дальнейшем могут применяться для управления, сохранения и использования ценных генетических ресурсов, а также отслеживания динамических изменений в молекулярной организации генома генофондной популяции с ограниченным поголовьем.