Изучение свойств свободной и иммобилизованной L-фенилаланин-аммоний-лиазы из Rhodosporidium toruloides на силохроме С-80

В последние годы все больше исследователей посвящают свои работы изучению процессов привязывания ферментов к твердой основе [1].

Свойства иммобилизованных ферментных препаратов часто значительно отличаются от свойств исходных растворимых ферментов, и их особенности зависят от вида фермента, источника его получения и способа пришивки на твердый носитель и условий реакционной среды [2].

При иммобилизации активность фермента может значительно снижаться за счет диффузионного сопротивления, экранирования активного центра, конформационной модификации [2, 3]. C другой стороны, активность иммобилизованных ферментов, пришитых методом ковалентной фиксации, может полностью сохраняться и даже повышаться [4]. За счет повышения стабильности фермента при иммобилизации количество превращенного с его помощью субстрата возрастает во много раз [5].

L-фенилаланин-аммоний-лиаза (ФАЛ, КФ 4.3.1.5) катализирует реакцию обратимого дезаминирования аминокислоты L-фенилаланина до транскоричной кислоты и аммиака [6]. Основным источником данного фермента являются клетки дрожжей. Фермент представляет интерес в качестве терапевтического средства для лечения фенилкетонурии, может быть использован как для прямой терапии фенилкетонурии, так и для производства полноценных продуктов питания, не содержащих фенилаланин [7].

Целью настоящей работы являлось изучение оптимальных условий иммобилизации L-фенилаланин-аммоний-лиазы из Rhodosporidium toruloides методом ковалентного связывания на си-лохроме С-80. Использование силохрома для получения иммобилизованных препаратов L-фенилаланин-аммоний-лиазы имеет ряд преимуществ по сравнению с другими носителями [8]. Си-

лохром является дешевым и доступным материалом, что создает перспективы внедрения иммобилизованных на нем ферментов в крупномасштабных промышленных процессах.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследований являлся фермент L-фенилаланин-аммоний-лиаза, выделенный из клеток дрожжей Rhodotorula glutinis (Sigma-Aldrich-Louis, США). Удельная активность препарата составляла в среднем 0,87 ед./мг белка.

В качестве носителя использовался силохром марки С-80 (ТУ 6-09-17-48-82) с радиусом пор от 250 до 1000 А и удельную площадь поверхности от 20 до 98 м2/г. Силохром предварительно обрабатывался γ-аминопропилтриэтоксисиланом для введения аминогрупп и затем глутаровым альдегидом.

Для иммобилизации к влажному модифицированному носителю добавляли 30%-ный раствор исходного препарата L-фенилаланин-аммоний-лиазы в количестве 10-15 ед. удельной активности на мг носителя. Процесс привязки фермента осуществлялся при перемешивании в ледяной бане в течение заданного промежутка времени при рН 7,4-7,5, после чего носитель отделяли на пористом фильтре от жидкости. Фильтрат проверяли на присутствие белка. Промывку иммобилизованного препарата вели до исчезновения в промывных водах следов белка. Отмытый иммобилизованный ферментный препарат осушивали на стеклянном фильтре под вакуумом и в дальнейшем использовали для изучения свойств.

Содержание белка определяли методом Дюма, основанным на измерении теплопроводности молекулярного азота, образующегося после сжигания анализируемого образца при температуре около 1000ºС в атмосфере кислорода и последующего восстановления всех образующихся оксидов азота при помощи восстанавливающего агента, с использованием прибора «Rapid N Cube» (Германия).

Активность нативного и иммобилизованного фермента оценивали по образованию транскоричной кислоты при 290 нм (рН 8,7; 30ºС) [9].

Количество образующейся транс-коричной ки-     Активность L-фенилаланин-аммоний-лиазы рас- слоты рассчитывали по увеличению светопоглоще-  считывали по формуле ния с использованием молярного коэффициента экс тинкции, равного 104 дм3∙см-1∙моль-1 [10].

(∆ A270 nm/min Test - ∆ A270 nm/min Blank) × (3) × (df)

Ед./мл фермента = ------------------------------------------------------------------------ ,

(19,73) × (0,01)

где 3 - суммарный объем (в мл) испытания; df – фактор растворения; 19,73 – миллимолярный коэффициент экстинции транс-коричной кислоты при длине волны 270 нм.

ед./мл фермента

Ед./мг белка = --------------------- мг белка

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для определения термостабильности свободного и иммобилизованного препарата L-фенилаланин-аммоний-лиазы реакционную смесь без L-фенилаланина прогревали в течение 5 минут при температуре от 20С° до 80°С. Нагревание проводили в 0,05 М трис-HCI буфере, рН 8,5. После этого добавляли L-фенилаланин, инкубировали реакционные смеси при 30°С на качалке и определяли L-фенилаланин-аммоний-лиазную активность.

Рис. 1. Зависимость удельной активности L-фенилаланин-аммоний-лиазы Rhodosporidium toruloides от температуры: 1 - свободный препарат, 2 – иммобилизованный препарат

Данные, представленные на рис. 1, свидетельствуют о том, что свободная L-фенилаланин-аммоний-лиаза Rhodosporidium toruloides сохраняет свою активность при нагревании реакционных смесей вплоть до 60°С, а иммобилизованные препараты – до 65°С. Дальнейшее увеличение температуры приводит к падению L-фенилаланин-аммоний-лиазной активности. Полная инактивация фермента обнаружена при 75°С как у свободной, так и у иммобилизованной L-фенилаланин-аммоний-лиазы.

Дальнейшие исследования направлены на изучение изменения активности свободной и иммобилизованной L-фенилаланин-аммоний-лиазы в процессе хранения. Результаты полученных исследований представлены в таблице 1.

Анализ данных таблицы 1 свидетельствует о том, что иммобилизованная L-фенилаланин-аммоний-лиаза в течение длительного времени сохраняет более высокую активность, чем свободная. За 8 месяцев хранения при +4°С или +6°С в 0,15 М трис-HCI буфере (рН 8,8) свободная L-фенилаланин-аммоний- лиаза теряет 50% своей активности, тогда как иммобилизованная сохраняет первоначальный уровень активности фермента.

Таблица 1 . Изменение активности свободной и иммобилизованной L-фенилаланин-аммоний-лиазы в процессе хранения (в мг транс-коричной кислоты/мг белка∙час)

Варианты	Время хранения, месяцы
	0	3	4	6	8
Свободная	0,02 7	0,02 7	0,02 2	0,01 2	0,01 2
Иммобилизован-	0,04	0,04	0,04	0,04	0,03
ная	0	0	0	0	7

Рис. 2. Зависимость L-фенилаланин-аммоний-лиазной активности Rhodosporidium toruloides от концентрации белка: 1-4 часа инкубации; а – свободный препарат, 2 – 20 часов инкубации; б – иммобилизованный препарат

Рис. 3. Зависимость L-фенилаланин-аммоний-лиазной активности Rhodosporidium toruloides от значений рН буфера (инкубация 4 часа): 1 – свободный препарат, 2 – иммобилизованный препарат

Также выяснили, что L-фенилаланин-аммоний-лиазная активность Rhodosporidium toruloides зависит от концентрации белка в реакционной смеси. Наибольшая активность фермента обнаружена при содержании белка от 3,0 мг/мл и выше в случае им- мобилизованной и от 7,0 мг/мл и выше в случае свободной (рис. 2).

Для определения оптимального значения рН действия свободной и иммобилизованной L-фенилаланин-аммоний-лиазы величину рН варьировали от 4 до 10,5. Результаты определения активности ферментов представлены на рис. 3.

В ходе исследований выяснили, что L-фенилаланин-аммоний-лиаза активна в пределах значений рН от 5,0 до 10,0. Оптимальное значение рН для проявления активности свободной и иммобилизованной L-фенилаланин-аммоний-лиазы одинаково и лежит в пределах от 8,8 до 9,1.

Кроме того, определили, что L-фенилаланин-аммоний-лиазная активность зависит от концентрации буфера (рис. 4). Максимальное значение ферментативной активности свободной и иммобилизо- ванной L-фенилаланин-аммоний-лиазы обнаруживается при концентрациях буфера от 0,2 М и сохраняется до 1,0 М. Низкие концентрации буфера нежелательны, поскольку не обеспечивают поддержания постоянных значений рН. При концентрации буфера ниже 0,1 М значения рН уменьшались до 8,8-8,2 (исходное значение рН 9,1).

Далее в работе изучалось влияние концентрации L-фенилаланина на количество образующейся транскоричной кислоты. Результаты исследований представлены на рис. 5.

Определили, что количество транс-коричной кислоты, образуемой как свободной, так и иммобилизованной L-фенилаланин-аммоний-лиазой Rhodosporidium toruloides , увеличивается при повышении исходной концентрации L-фенилаланина в реакционной смеси.

Рис. 4. Зависимость L-фенилаланин-аммоний-лиазной активности Rhodosporidium toruloides от концентрации буфера (инкубация 4 часа): А – трис-HСI буфер с рН 9,1, Б – боратный буфер с рН 9,1. Удельная ФАЛ-активность: 1 – свободный препарат, 2 – иммобилизованный препарат. рН конечный: 3 – свободный препарат, 4 – иммобилизованный препарат

С увеличением исходного содержания L-фенилаланина возрастает и количество трансформированной аминокислоты, этот процесс сопровождается образованием аммиака и транс-коричной кислоты (рис. 6).

Максимальное количество L-фенилаланина, которое может быть трансформировано за 20 часов при 30°С, составляет для свободной L-фенилаланин-аммоний-лиазы 15,0 г/л (90 мкМ/мл), а для иммобилизованной – 12,5 г/л (73 мкМ/мл) при начальном содержании аминокислоты 45 г/л. Однако при этом иммобилизованный фермент по сравнению со свободным обладает большей удельной L-фенилаланин-аммоний-лиазной активностью (0,07 и 0,05 мг транс – коричной кислоты/мг белка∙час, соответственно).

иммобилизованный препарат L-фенилаланин-аммоний-лиазы Rhodosporidium toruloides

Рис. 6. Трансформация L-фенилаланина L-фенилаланин-аммоний-лиазой Rhodosporidium toruloides . 1 – свободный препарат (13 мг/мл белка), 2 – иммобилизованный препарат (12,5 мг/мл белка)

Рис. 5. Зависимость образования транс-коричной кислоты клетками от концентрации L-фенилаланина в реакционной смеси (инкубация 4 часа) 1 – свободный препарат, 2 –

Рис. 7. Трансформация L-фенилаланина L-фенилаланин-аммоний-лиазой при разной температуре.              -

свободный препарат, - иммобилизованный препарат. 1, 2 – 28°С; 3,4 – 37°С; 5,6 – 45°С

Количество трансформированного L-фенилаланина увеличивается при повышении температуры инкубации реакционных смесей (рис. 7).

Свободная и иммобилизованная L-фенилаланин-аммоний-лиаза при 30°С полностью трансформирует 2,5 г/л L-фенилаланина (15 мкМ/мл), а при 37°С и 45°С - 3,75 г/л (20 мкМ/мл). Скорость дезаминирования L-фенилаланина также возрастает при увеличении температуры инкубации. Например, при 37°С свободная L-фенилаланин-аммоний-лиаза трансформирует 3,75 г/л L-фенилаланина за 12 часов, а при 45°С - за 4 часа. Иммобилизованная L-фенилаланин-аммоний-лиаза в первые часы инкубации проводит трансформацию L-фенилаланина несколько медленнее, а затем так же интенсивно, как и свободная.

ВЫВОДЫ

В результате проделанной работы были подобраны условия, при которых свободная и иммобилизованная L-фенилаланин-аммоний-лиаза полностью трансформирует 15-20 мкМ/мл (2,5-3,75 г/л) L-фенилаланина.

Впервые получены препараты иммобилизованной на силохроме С-80 L-фенилаланин-аммоний-лиазы. Сопоставление данных по свободному и иммобилизованному ферменту свидетельствует о том, что иммобилизация L-фенилаланин-аммоний-лиазы на силохроме С-80 благоприятно сказывается на свойствах фермента. Иммобилизованная L-фенилаланин-аммоний-лиаза в течение длительного времени сохраняет более высокую активность, чем свободная. При термообработке препараты иммобилизованного фермента обнаруживают более высокую L-фенилаланин-аммоний-лиазную активность по сравнению со свободным. Однако полная инактивация как свободной, так и иммобилизованной L-фенилаланин-аммоний-лиазы наступает при одина- ковых условиях. Кроме того, показано повышение рН-стабильности фермента после иммобилизации.

Сравнение свойств свободной и иммобилизованной L-фенилаланин-аммоний-лиазы показало, что процесс иммобилизации не оказывает значительного влияния на действие фермента. Иммобилизованный фермент так же хорошо, как свободный, осуществляет неокислительное дезаминирование L-фенилаланина.

Работа выполнена в рамках Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы, госконтракт № 02.740.11.5133.