Изучение токсичности Serratia ficaria TP3 по отношению к окружающий среде методами биотестирования

Введение. Для определения уровня токсичности окружающей среды, различных веществ, штаммов микроорганизмов часто используют метод биотестирования. В экспериментах используются тест-объекты, которые способны быстро реагировать на воздействие токсиканта, при этом изменяются его количественные характеристики. Совокупность биохимических реакций, которые происходят в тест-объекте, позволяет в полной мере оценить воздействие поллютанта и продуктов его биотрансформации на клеточном и организменном уровнях [1].

Биотестирование –– определение токсичности пробы (воды, почвы, суспензии и т.д.) для данного организма в лабораторном эксперименте. В основе данного метода исследования лежит биологическое моделирование. Каждая модель является формой отражения действительности. При биотестировании происходит перенос знаний с простой системы (смоделированной экосистемы в лабораторном опыте) на более сложную (экосистему в реальных условиях). Подопытные организмы в рамках одного эксперимента должны быть визуально одинаковыми [2].

При определении степени токсичности исследуемой суспензии методами биотестирования большое значение имеет чувствительность к токсикантам подопытных организмов. Поэтому актуальность исследований и интерес к биотест-системам возрастает. Используя методы биотестирования, можно в короткие сроки оценить уровень токсичности природных и техногенных сред, получить достоверную информацию о токсичности конкретного образца пробы [3]. Наиболее корректный результат достигается при использовании нескольких тест-объектов из разных систематических групп. В нормативных документах [4] рекомендовано использовать минимум два тест-организма. В наших экспериментах использовано несколько тест-объектов из разных систематических групп.

Самые распространённые тест-объекты — одноклеточные водоросли, ракообразные, рыбы, моллюски.

Пресноводные рачки дафнии в настоящее время считаются наиболее чувствительными и универсальными тест-объектами, поэтому применяются при биотестировании сточных и природных вод, донных осадков, почв и промышленных отходов. С помощью дафний определяют острую и хроническую токсичность контролируемых объектов.

Пресноводные аквариумные рыбы гуппи также часто используются для проведения биотестирования. Данные тест-объекты имеют достаточно крупные размеры, легко культивируются, высокочувствительны к различным токсикантам (хрому, меди, кадмию, ртути) и их комбинированному (аддитивному) действию, а также хлору, тяжелым металлам, пестицидам, аммиаку, полихлорфенилам) и др. [5].

Целью исследований являлось изучение токсичности штамма Serratia ficaria TP3 на различных организмах.

Условия, материалы и методы. В ходе проведения исследований были использованы микробиологические методы, которые включают выделение и учет численности микроорганизмов, исследование морфологических, культуральных и физиолого-биохимических свойств микроорганизмов, определение фунгицидной активности штаммов [6; 7], определение фитотоксичности и фитостимулирующей активности микроорганизмов [8; 9]. Предварительную идентификацию микроорганизмов проводили по культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим признакам, используя определитель бактерий Д.Х. Берджи [10].

Биотестирование выполнено на 44 самцах белых беспородных крыс ( Rattus norvegicus f. domesticus ), гуппи ( Poecilia reticulata Peters, 1859), дафниях ( Daphnia magna Straus, 1820 ) и одноклеточных зеленых водорослях хлорелла ( Chlorella vulgaris Beijer, 1890). Определяли острую и хроническую токсичность.

Крысы были разделены на следующие группы: 1 группа – контроль (животные, получавшие физиологический раствор); 2 группа – животные, получавшие раствор Serratia ficaria ТР3 с титром клеток 10⁹ КОЕ/мл. Суспензию получали путем внесения 2-ух петель биомассы трехсуточной культуры Serratia ficaria TP3 со скошенного картофельного агара и вносили в 200 мл картофельного отвара. Культивировали на качалке при непрерывном перемешивании (120 об/мин) в течение 24 ч при температуре 28 °С. Для приготовления раствора культуры Serratia ficaria TP3 50 мл суспензии вносили в 1 л картофельного отвара и культивировали на качалке в том же режиме. Суспензии вводили внутрижелудочно в дозе 1 мл в течение 7 дней. Декапитацию животных проводили после предварительной наркотизации диэтиловым эфиром [11–13]. Исследование выполнено при соблюдении правил гуманного обращения с животными [14].

Биотестирование раствора на гуппи проводили в аквариумах объемом 50 дм3, обеспечивая плотность посадки тест-объектов из расчета 1–2 дм3 воды на 1 экз. Аквариум заполняли водой, отстоянной в течение 7 суток, рН 8,0–8,5, температура 25–27 °С. Кормили гуппи 1–2 раза в сутки сухим (дафнии, циклопы) кормом. Корм вносили в таком количестве, чтобы рыбы съедали его без остатка за 3–5 мин, так как излишки приводят к ухудшению качества воды в аквариуме. В каждый из опытных и контрольных аквариумов помещали по 10 экз. гуппи в возрасте 24–48 ч. Продолжительность биотестирования составляла 96 ч. Во время биотестирования рыб не кормили. Ежедневно подсчитывали количество живых рыб и удаляли погибших. Погибшими считают рыб, которые не подают признаков движения или дыхания при прикосновении к ним стеклянной палочкой [15].

Маточную культуру дафний выращивали в климатостате в стеклянных стаканах при температуре 27 ± 1 °С и освещении лампами дневного света 800– 1000 лк при фотопериоде 12 ч +12 ч. В качестве культивационной воды использовали отстоянную водопроводную воду. Дафнию кормили смесью суспензии дрожжей и водоросли хлорелла в пропорции 7:1. Для кормления использовали суспензию водоросли, которую после осаждения центрифугированием ресуспензировали в культивационной воде.

Для тестирования в стаканчики объемом 150 мл отбирали по 100 мл анализируемой и культивационной воды. В каждый стакан помещали по 30 шт. дафний с помощью сачка из планктонной сетки или пастеровской пипеткой [16]. Каждую пробу исследуемой воды анализировали в трех повторностях.

Экспонировали их при температуре 22 ± 20 °С 96 ч. В течение всего времени биотестирования рачков не кормили. Результаты биотестирования считают правильными, если гибель дафний в контроле не превышает 10 % за весь период наблюдений и концентрация кислорода в тестируемой воде в конце опыта составляет не менее 2 мг/л. Учет выживших дафний проводили через 1 ч, 6 ч, 12 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч и 96 ч. Рачков считают выжившими, если они свободно передвигаются в толще воды или всплывают со дна не позднее 15 с после легкого покачивания стакана. Расчет погибших дафний в тестируемой воде по сравнению с контролем рассчитывали по формуле 1:

А = (Хк – Хт) 100/Хк, %, (1)

где: Хк — среднеарифметическое количество дафний, выживших в контроле; Хт — среднеарифметическое количество дафний, выживших в тестируемой воде.

Водоросль хлореллу выращивали в культиваторе КВ-05 при непрерывном искусственном освещении в 10 % среде Тамия при 36 °С [17].

Для проведения эксперимента в колбу емкостью 250 мл наливали 100 мл исследуемого раствора, помещали туда водоросли из расчета 25–35 тыс. кл./см2. Время проведения опыта составило 72 ч.

При изучении токсичности раствора на водорослях оценивали изменение численности клеток, учет мертвых и живых клеток. Подсчет клеток производили в камере Горяева (объектив ×40).

Содержание клеток определяли по формуле 2:

N=a×4000×b / b , (2)

где: n — количество клеток в 1 мкл среды; а — количество клеток, подсчитанных в объеме камеры; b — количество больших квадратов камеры, b —разведение.

Статистическую обработку данных проводили с использованием t-критерия Стьюдента. Достоверно значимыми считали изменения при p<0,05.

Результаты и обсуждение. В ходе проведения исследований на крысах установлено, что введение раствора культуры Serratia ficaria TP3 значительно не изменяло показатели крови крыс (Табл. 1).

Таблица 1 — Влияние раствора культуры Serratia ficaria TP3 на показатели крови крыс

Показатель	Контроль	Опыт
Гемоглобин, г/л	247,7 ± 12,79	265,9 ± 11,47
Общее количество лейкоцитов, 103/л	100,9 ± 8,51	69,2 ± 6,10***
Общее количество эритроцитов, 1012/л	511,4 ± 45,16	613,5 ± 40,3

Примечание*** — достоверность различий по сравнению с контролем (р ≤ 0,001)

Как видно из таблицы 1, уровень гемоглобина также практически не изменялся при введении раствора культуры Serratia ficaria TP3. При введении суспензий происходило снижение общего количества лейкоцитов относительно контрольной группы.

В таблице 2 представлены результаты исследования влияния раствора Serratia ficaria TP3 на свободно радикальное окисление.

Таблица 2 — Влияние раствора Serratia ficaria TP3 на процессы свободно радикального окисления в тканях печени и почек и перекисный гемолиз эритроцитов

Показатель	Контроль	Опыт
ТБК-активные продукты в печени, мкмоль/л	5,9 ± 0,60	6,8 ± 0,23
Каталазная активность в печени, ед./мг белка	1,8 ± 0,02	1,0 ± 0,06***
Каталазная активность в почках, ед./мг белка	1,7 ± 0,02	1,21 ± 0,032***
ТБК-активные продукты в почках, нмоль/л белка	11,6 ± 1,31	6,1 ± 0,38***
Перекисный гемолиз эритроцитов, мкмоль/мл	14,5 ± 2,00	10,8 ± 2,49

Примечание*** — достоверность различий по сравнению с контролем (р ≤ 0,001)

Введение раствора культуры Serratia ficaria TP3 приводил к небольшому возрастанию уровня ТБК-активных продуктов в ткани печени. Каталазная активность и в ткани печени, и в ткани почек снижалась под действием введения суспензий. Раствор культуры Serratia ficaria TP3 приводил к снижению каталазной активности в ткани печени на 44 %, а в тканях почки на 29 %, относительно аналогичного показателя у контрольных животных.

Раствор культуры Serratia ficaria TP3 приводил к уменьшению уровня ТБК-активных продуктов в почках на 47 % в сравнении с аналогичным показателем у контрольных животных. Влияние суспензий на перекисный гемолиз эритроцитов было незначительным. Данные изменения показателей крови и свободного радикального окисления в тканях печени и почек свидетельствуют об адаптации организма к введению суспензии исследуемого изолята.

При проведении анализа разнообразия микроорганизмов в фекалиях крыс, которых пропаивали физиологическим раствором и экстремальной концентрацией раствора культуры Serratia ficaria TP3 получены следующие результаты (Табл. 3).

Таблица 3 — Микробиологический анализ фекалий крыс

Физиологический раствор	Serratia ficaria TP3
1) 5 колоний белого цвета, с ризоидном краем, выпуклые, слизистые, Г + палочки 2)1 колония белого цвета, блестящая, с ровным краем, дрожжевидная, Г+ палочки 3) 4 колонии мицелиальные зеленого цвета, бархатистые, снизу белого цвета, выделяют экссудат р. Pinicillium	1) 8 колоний белооранжевого цвета, выпуклые, слизистые, Г+ палочки и пустые клетки

1)    2 колонии белого цвета, блестящие, с ровным краем, дрожжевидные, Г+ палочки 2)    1 колония мицелиальная зеленого цвета, бархатистая, снизу белого цвета, выделяет экссудат р. Pinicillium	2) 10 колоний белого-оранжевого цвета, выпуклые, слизистые, Г+ палочки и пустые клетки
1) 11 колоний белого цвета, с ризоидным краем, выпуклые, слизистые, Г + палочки	3) 7 колоний белооранжевого цвета, выпуклые, слизистые, Г+ палочки и пустые клетки
1)    2 колонии белого цвета, с ризоидным краем, выпуклые, слизистые, Г + палочки 2)    7 колоний мицелиальная зеленого цвета, бархатистые, снизу белого цвета, выделяют экссудат р. Pinicillium	4) 2 колонии белооранжевого цвета, выпуклые, слизистые, Г+ палочки и пустые клетки

Микрофлора фекалий крыс при пропаивании физиологическим раствором более разнообразна и представлена бактериальными и мицелиальными микроорганизмами. При пропаивании экстремальной концентрацией клеток Serratia ficaria TP3 на чашках Петри при изучении фекалий методом отпечатков был найден только один штамм.

При анализе микрофлоры внутренних органов крыс также отмечено, что с увеличением времени пропаивания разнообразие микроорганизмов снижается. Это указывает на то, что снижается развитие плесневых грибов.

При проведении исследований по воздействию раствора культуры Serratia ficaria TP3 на гуппи установлено, что данный штамм не оказывает никакого влияния — гибель рыбы в растворе в течение 24–96 ч не отмечалась. Поэтому, данный раствор можно отнести к V классу — практически не опасные растворы, экологическая система не нарушена.

При проведении биотестирования на дафниях также не установлено влияния раствора Serratia ficaria TP3 в течение 24–96 ч, что говорит об отсутствии токсичности .

В таблице 4 представлены результаты проведения биотестирования на водорослях.

Таблица 4 – Результаты биотестирования раствора Serratia ficaria TP3 на водорослях

Вариант раствора	Численность водорослей, тыс. кл./см3 через 72 ч	% отклонения от контроля	% достоверно сти	Класс опасности
				Тест-объект	ОПС
Контроль	608 ± 194	5	20	V	V
Опыт	579 ± 189	5		V	V

Из таблицы 4 видно, что содержание мертвых клеток минимально и не превышает допустимые значения (20 % от контроля), что, как и в предыдущих опытах, указывает на безвредность исследуемого раствора.

Таким образом, раствор культуры клеток Serratia ficaria TP3 не оказывает негативного влияния на организмы различных систематических групп, что согласно Санитарным правилам СП 2.1.7.1386-03 [18] соответствует V классу опасности. Является безопасным с учетом комбинированного, комплексного действия его компонентов и продуктов его трансформации на здоровье человека и среду его обитания и может быть рекомендован, как безопасное средство, обладающее хозяйственно-полезными свойствами.

Выводы. При проведении исследований на белых беспородных крысах отмечено, что введение исследуемого раствора не оказывает токсического воздействия на физиологическое состояние исследуемых объектов.

Результаты биотестирования показали, что раствор Serratia ficaria ТР3 не токсичен для одноклеточных водорослей, не оказывает влияния на дафний и гуппи.

Таким образом, раствор Serratia seratia ТР3 согласно Санитарным правилам СП 2.1.7.1386-03 [18], соответствует V классу опасности, т.е. является безопасным для здоровья человека и среды его обитания.

Полученные результаты имеют практическую значимость для обоснования биобезопасности потенциального биопрепарата для использования его в системах аквакультуры и экологически ориентированных технологий.

Исследования проведены в рамках выполнения проекта «Разработка интегрированных индустриальных биотехнологических методов аквакультуры для снижения нагрузки на природные популяции гидробионтов, сохранения биоразнообразия, получения экологически чистой продукции и восстановления биологического акваресурса» FMRE-2025-0077.