Изучение травы белокудренника черного с целью создания новых лекарственных средств

лекарственных средств и стандартизация сырья является актуальным.

Цель работы: выявить диагностические признаки травы белокудренника черного; изучить надземную часть растения на присутствие БАС; провести их количественный анализ.

Материал и методика. Материалом для исследований служила трава белокудренника черного, собранные в фазу цветения (Ростовская область, Ставропольский край). На предварительном этапе выявляли характерные диагностические признаки сырья. Его обрабатывали смесью 95% спирта, глицерина и воды (1:1:1) или 3% раствором натрия гидроксида, готовили срезы стебля, листа, цветка, исследовали их с помощью микроскопа. Для предварительной идентификации БАС сырья были получены водные и спиртоводные извлечения (40%, 70%, 96% растворы этанола) из травы белокудренника черного. Для получения извлечений 5,0 г (точная навеска) измельченной травы заливали экстрагентом и нагревали на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 1 часа. Вытяжки сливали, фильтровали, операцию повторяли дважды. Извлечения, полученные после трехкратной экстракции, объединяли, упаривали до 25 мл, использовали для проведения качественных реакций по методикам ГФ XI и ГФ XII [1, 2] и расчета содержания экстрактивных веществ. Водные вытяжки использовали для определения углеводных соединений, дубильных веществ, органических кислот, аминокислот, сапонинов, спиртоводные - для определения флавоноидов.

Для качественного анализа полифенольных соединений в спиртоводных извлечениях использовали методы бумажной и тонкослойной хроматографии (ТСХ). В качестве неподвижной фазы использовали хроматографическую бумагу марки «Ленинградская-С». Системой растворителей служили: н-бутанол–уксусная кислота–вода (4:1:2) для бумажной восходящей хроматографии; 15% уксусная кислота и 2% уксусная кислота для ТСХ.

Проявление зон адсорбции БАС осуществляли следующими способами:

• 1)    просматривали в УФ свете и отмечали собственную флуоресценцию веществ;

• 2)    обрабатывали парами аммиака и просматривали в УФ свете;

• 3)    просматривали в видимом и УФ свете после обработки 5% спиртовым раствором алюминия хлорида;

• 4)    обрабатывали 5% спиртовым раствором гидроксида натрия и отмечали зоны адсорбции в видимом свете;

• 5)    обрабатывали 0,04% водным раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия.

Далее было определено наличие свободных органических кислот в сырье белокудренника черного. Для этого использовали метод ТСХ. Пластинки «Силуфол УФ-366», система растворителей: 95% этанол: раствор аммиака (16:4,5), проявитель – раствор бромкрезолового зеленого. Содержание макро-и микроэлементов в траве белоку-ренника черного определяли спектральным методом на базе испытательной лаборатории при ФГУП «Кавказгеолсъемка» (г. Ессентуки) по методике предприятия. Пробу измельченного сырья массой 10,0 г (точная навеска) минерализовали методом сухого разложения в фарфоровых тиглях при температуре 4500С до получения белой золы. Зольный остаток обрабатывали 5 мл смеси, состоящей из концентрированной азотной, серной кислоты и воды (1:1:1) и выпаривали на водяной бане досуха. Остаток растворяли в 15 мл 1% раствора азотной кислоты, количественно переносили в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводили объем до метки тем же растворителем. Атомноадсорбционное определение элементов проводили на спектрофотометре ДФС-8-1 при определенных аналитических параметрах.

После качественного анализа сырья был проведен его количественный анализ на содержание полисахаридов, дубильных веществ, флавоноидов, кислот (фенолкарбоновых и органических). По методикам ГФ XI и ГФ XII [1, 2], определяли товароведческие показатели сырья, необходимые для расчета количественного содержания основных БАС. Выделение полисахаридов для количественного анализа проводили по методике Н.К. Кочеткова [4]. Очистку сырья от липофильных соединений осуществляли с помощью последовательного добавления хлороформа и 95% спирта. 3-х кратную экстракцию полисахаридов проводили, используя соотношение сырья и экстрагента 1:20, на водяной бане с обратным холодильником по 30 мин. Полученные водные извлечения объединяли, сгущали под вакуумом, осаждали 2-х кратным объемом 95% спирта. Осадок отделяли центрифугированием, высушивали при 400С и взвешивали – получали водорастворимый полисахаридный комплекс (ВРПС). Шрот, полученный после отделения ВРПС, заливали водой, прибавляли концентрированную хлористоводородную кислоту и экстрагировали на водяной бане с обратным холодильником в течение 30 минут. После охлаждения до комнатной температуры извлечение фильтровали и осаждали 2-х кратным объемом 95% спиртом. Осадок отделяли центрифугированием, высушивали и взвешивали – получали пектиновые вещества (ПВ). Шрот после выделения ПВ экстрагировали 10% раствором натрия гидроксида при комнатной температуре в течение 12 часов. Извлечение фильтровали и осаждали 50% раствором уксусной кислоты – отделяли осадок гемицеллюлозы А. В фильтрате после отделения гемицеллюлозы Б осаждали гемицеллюлозу Б 2-кратным объемом 96% спирта. Все полученные фракции высушивали и взвешивали.

Для количественного определения дубильных веществ в водном извлечении из травы бело-кудренника использовали перманганатометрию с индикатором индигосульфокислотой [1, 2]. Содержание суммы фенольных соединений в пересчете на хлорогеновую кислоту определяли спектрофотометрически по методике ГФ ХI [1] при длине волны 325 нм. Аминокислотный состав определяли на аминокислотном анализаторе BiotronicLC-15001 на базе лаборатории патологии обмена веществ животных ГУП НИИЖК (г. Ставрополь) с использованием внутреннего стандарта. При работе с автоматизированным аминокислотным анализатором смесь аминокислот, получаемых после полного кислотного гидролиза в 6 М р-ре кислоты хлористоводородной, высушивали в сушильном шкафу при 1050С в течение 24 часов. Расчеты проводили по величине площади каждого пика с помощью логарифмической линейки, прилагаемой к анализатору. Наличие флавоноидов в сырье также подтверждали по УФ спектрам спирто-водного извлечения из травы белокудренника черного с 2% р-ром алюминия хлорида. При этом отмечен максимум поглощения при 430±2 нм, характерный для кверцетина. Для количественного определения суммы флавоноидов применили дифференциальную спектрофотометрию [1, 2].

Для определения антимикробной активности водного и спиртоводных извлечений (40%, 70% растворы этанола) из травы белокудренника черного использовали метод диффузии в агар (способ «колодцев»), основанный на угнетении роста тест микроорганизмов исследуемым образцом [3]. Определение проводили по отношению к 10 тест-культурам. Для определения антимикробной активности использовали 24-часовые тест-культуры, выращенные на мясопептонном агаре. Микробные культуры смывали 2-3 мл физиологического раствора и готовили взвесь, содержащую 500 млн. микробных тел в 1 мл, по стандарту мутности. В лунки вносили по 0,1 мл испытуемого извлечения, в качестве контроля использовали растворитель в соответствующей концентрации. Результаты учитывали по диаметру зон задержки роста вокруг «колодца», включая диаметр самого колодца. Интерпретацию результатов проводили по следующим критериям: отсутствия зоны задержки роста – испытуемая культура не чувствительна к данной концентрации испытуемого образца; диаметр зоны задержки 10 мм – умеренная чувствительность;

диаметр задержки роста более 10 мм – высокая чувствительность испытуемой культуры к данной концентрации испытуемого образца.

Результаты. Было изучено анатомическое строение стебля, листа, цветка белокудренника черного. Покровной тканью стебля является эпидерма. Коровая часть неширокая, состоит из трехчетырех рядов клеток овальной формы, несколько тангентально удлиненных. В ребрах стебля наблюдаются мощные участки колленхимы. Паренхима коры, расположенная под ними, состоит из нескольких рядов вытянутых клеток. Осевая часть стебля отделена от коровой эндодермой, состоящей из крупных клеток овальной формы. Проводящая система образует сплошные кольца флоэмы и ксилемы, наиболее развитые в ребрах. Отдельными группами встречаются лубяные волокна. Сердцевина стебля состоит из тонкостенных округлых клеток с постепенно увеличивающимися размерами по направлению к центральной полости. Между клетками заметны трех-четырехугольные межклетники. При микроскопическом исследовании поверхностных препаратов верхней и нижней эпидермы листа видно, что клетки верхней эпидермы крупные, слабоизвилистостенные, а нижней – глубокоизвилистостенные, более мелкие. На верхней эпидерме листа устьица отсутствуют. Здесь в значительном количестве встречаются простые двух-, реже трехклеточные толстостенные волоски с бородавчатой кутикулой, а также редко наблюдаются головчатые волоски на одноклеточной и трехклеточной ножке. На нижней эпидерме листа находятся устьица в значительном количестве. Они сопровождаются двумя, реже тремя- четырьмя клетками. Здесь, в отличие от верхней эпидермы, встречаются простые одно- и двухклеточные более короткие волоски. Головчатые волоски на нижней и верхней эпидерме листа аналогичны. Редко встречаются эфирномасличные железки с крупными головками, характерными для семейства губоцветных (яснотковых). Внешняя эпидерма чашечки цветка состоит из извилистостенных клеток. Устьица – в незначительном количестве, сопровождаются двумя, очень редко четырьмя-шестью клетками. На внешней эпидерме в большом количестве встречаются простые короткие одноклеточные и двуклеточные (на жилках) волоски с бородавчатой кутикулой. Реже наблюдаются головчатые волоски с двуклеточной головкой на одноклеточной ножке. Внутренняя эпидерма состоит из сильно извилистостенных клеток. Устьица отсутствуют. В значительном количестве встречаются простые одноклеточные короткие волоски и двуклеточные с бородавчатой кутикулой, а также головчатые. Характерной особенностью чашечки цветка является наличие в средней части краев зубчиков головчатых волосков на длинной трех-четырехклеточной ножке с крупной двуклеточной головкой.

Результаты определения величин влажности и экстрактивных веществ, полученных после экстракции травы белокудренника черного различными растворителями, приведены в табл. 1. Из данных, представленных в табл. 1 следует, что наибольшее количество экстрактивных веществ из травы белокудренника черного извлекается 40% этанолом.

Таблица 1. Товароведческие показатели травы белокудренника черного

В водном извлечении травы белокудренника черного были обнаружены: полисахариды, дубильные вещества конденсированной структуры, тритерпеновые сапонины, органические кислоты (аскорбиновая, щавелевая, яблочная и янтарная). При изучении полисахаридов были идентифицированы водорастворимые полисахариды; пектиновые вещества, гемицеллюлоза А и гемицеллюлоза Б. В водном извлечении найдено 15 аминокислот (глутаминовая кислота, глицин, аланин, изолейцин, лейцин, треонин, валин, метионин, изолейцин, тирозин, гистидин). Кроме того, установлено, что сырье и водное извлечение из него богато биологически активными макро-, микро- и ультрамикроэлементами (всего найдено 20 биоэлементов), из которых 10 являются эссенциальными (K, Na, Ca, Mg, Cu, Zn, Mn, Fe, Co, Li) и 4 – условно эссенциальными (Ni, Ti, V, Cr). При этом наибольшее содержание приходится на K, Ca, Cr, Mg, P и Fe. В спиртоводных извлечениях (40% и 70%) были обнаружены флавоноиды (рутин, кверцетин), фенолкарбоновые кислоты (хлорогеновая и кофейная). Количественное содержание отдельных БАС в траве белокудренника черного составило: полисахаридов - 13,71% (в том числе: ВРПС – 3,45±0,08%; ПВ – 0,32±0,04%; ГЦА – 2,49 ±0,11%; ГЦБ – 7,47±0,12%), дубильных веществ в пересчете на танин - 9,44±0,25%; аминокислот - 11,82 мг/%; флавоноидов в пересчете на кверцетин -1,82±0,07%; фенолкарбоновых кислот в пересчете на хлорогеновую кислоту - 2,83±0,03%; кислоты аскорбиновой - 0,27±0,04%; органических кислот в пересчете на яблочную кислоту - 0,41±0,06%. Результаты изучения антимикробной активности извлечений из травы белокудренника черного представлены в табл. 2.

Таблица 2. Изучение антимикробной активности извлечений из травы белокудренника черного

Примечание : используемые тест культуры: 1. Staphylococcus aureus(209); 2. Staphylococcus aureus (Макаров); 3. Staphylococcus aureus (Туре); 4. Staphylococcus epidermidis Wood-46; 5. Escherichia coli 675; 6. Escherichia coli 055; 7. Salmonella galenarum; 8. Bacillus subtilis L 2 ; 9. Bacillus anthracoides – 1; 10. Bacillus anthracoides – 96

Из данных, представленных в таблице 2 следует, что извлечения из травы белокудренни-ка черного обладают антимикробной активностью в отношении стафилококков, бактерий кишечной группы и не оказывают действия на споровые культуры. Наибольшей активностью обладает вытяжка, полученная с помощью 40% этанола.

Выводы: данные проведенных исследований позволяют продолжить дальнейшее изучение и использование извлечения из травы бело-кудренника черного, полученного с помощью 40% этанола, в качестве потенциального антимикробного средства для лечения заболеваний, вызванных патогенными стафилококками, бактериями кишечной группы и протея.