Изучение влияния биостимуляторов на активность бактериальных и грибных гидролаз

Начало XXI века можно без преувеличения назвать эпохой биотехнологий, которые всё шире применяются в различных отраслях промышленности и науки.

Одним из основных направлений биотехнологии является применение ферментов (энзимов), которые являются белками-катализаторами, избирательно воздействующие и вызывающие многократное ускорение химических реакций.

В настоящее время ферменты применяют в составе синтетических моющих средств (для удаления загрязнений белковой, жировой природы, а также растительного происхождения); в производстве целлюлозно-бумажной продукции (отбеливание целлюлозы без применения хлора, вторичная утилизация целлюлозы); в пищевой промышленности (изготовление сыров и молока, не содержащего лактозу, мягчение мясного сырья, производство модифицированных жиров и масел); в производстве фармацевтических препаратов, комбикормов, текстиля.

Одним из перспективных направлений биотехнологии является биоконверсия растительного сырья. Популярность этого направления обусловлена прогрессирующим дефицитом невозобновляемых источников энергий и материалов.

Биоконверсия – это процесс переработки микроорганизмами сырья растительного происхождения, происходящий в аэробных или анаэробных условиях. Целлюлазы, как и многие другие биологически активные вещества, получают путем выращивания микроорганизмов и высших грибов на растительном сырье. Такой процесс является примером прямой биоконверсии растительного сырья – твердофазного культивирования.

Целлюлазами называют комплекс целлюлолитических ферментов, под действием которых происходит деструкция целлюлозы и ее производных до глюкозы и олигосахаридов. Во многих производствах, сырьем для которых служат отходы переработки растений, успешно применяют целлюлолитические ферменты. В таблице 1 приведены основные сферы применения целлюлаз.

Таблица 1.

Основные сферы применения целлюлаз

Table 1.

The main spheres of cellulase application

Область применения | Application area	Способ применения | Wау of application
Пищевая промышленность Food industry	Экстракция и осветление соков, нектаров. Получение каротина и пищевых красителей. Размягчение сырья для виноделия. Добавка для омолаживания ячменя при пивоварении | Extraction and clarification of juices, nectars. Preparation of carotene and food colorings. Softening of raw materials for winemaking. Additive for barley rejuvenation during brewing
Производство детергентов | Manufacture of detergents	Энзимная добавка в синтетические моющие средства | Enzyme additive in synthetic detergents
Текстильная промышленность | Textile industry	Придание мягкости хлопчатобумажным тканям | Softening of cotton fabrics
Целлюлозно-бумажная промышленность | Pulp and paper industry	Размягчение целлюлозного сырья, отбеливание. Утилизация отходов | Softening of cellulose raw materials, bleaching. Recycling
Сельское хозяйство | Agriculture	Добавка к кормам, повышающая питательную ценность. Заготовка фуража | Additive to feed, increasing nutritional value. Procurement of forage

Целлюлазы синтезируются исключительно микроорганизмами (бактериями, микроскопическими грибами и актиномицетами). Такие микроорганизмы, в большинстве своем, из всех компонентов питательных сред в качестве источника энергии используют только целлюлозу. В промышленности используется сравнительно небольшое количество видов микроорганизмов, в основном это штаммы грибов родов Trichoderma, Aspergillus, Phanerochaete .

Проведенный анализ литературных данных показал, что ранее были проведены исследования, посвященные методам усиления целлюлазной активности микроорганизмов путем модификации питательных сред: добавления витаминов, минеральных веществ, биорегуляторов. Также есть данные о повышении целлюлолитической активности базидиомицетов Lentinus edodes. (Berk. Sing.) под действием 2,4-эпибрассино-лид. В связи с эти целесообразными являются исследованию стимулирующего действия эпина на целлюлолитическую активность микроскопических грибов и бактерий.

Нами было изучено влияние регуляторов роста на целлюлолитическую активность грибов и бактерий, в зависимости от концентрации и времени воздействия вещества.

Вещества данного класса используют для предотвращения полегания культур, повышения урожайности и качества выращиваемой продукции, ускорения созревания и лучшей завязываемости плодов.

Материалы и методы исследования

В работе использовались штаммы микроорганизмов родов Bacillus, Alternaria, Tricho-derma , способные к биодеградации целлюлозы, которые были получены из Всероссийской коллекции микроорганизмов.

В качестве усилителей целлюлолитической активности использовались биорегуляторы эпин (2,4-эпибрассинолид) и гетероауксин (β-индоли-луксусная кислота) в различных концентрациях. Основным действующим веществом в эпине является 2,4-эпибрассинолид – стрессовый адаптоген растений. Эпин является полностью синтетическим, но безопасным для растений. Действующее вещество гетероауксина – β-индолилуксусная кислота – образуется в растениях и влияет на их ростовые процессы.

Культивирование микроорганизмов проводили в колбах Эрленмейера объемом 250 мл на жидкой питательной среде на основе подсолнечного шрота, в качестве источника азота добавляли мочевину. Колбы со средой автоклавировали при температуре 121 °С на протяжении 20 мин, перед засевом охлаждали до комнатной температуры.

Для эксперимента применяли растворы эпина и гетероауксина в следующих разведениях: 10-1, 10-6, 10-7. Каждый регулятор в каждом разведении добавляли в отдельную колбу со средой на основе шрота в количестве 1 мл.

Каждый штамм микроорганизмов выращивали на питательной среде на основе подсолнечного шрота с добавлением вышеуказанных биорегуляторов.

Для определения целлюлолитической активности были применены луночный метод на среде Гетчинсона с добавлением 10 г./л карбометилцеллюлозы (КМЦ), а также способность красителя конго-красный образовывать комплекс с целлюлозой.

Для бактерий рода Bacillus было произведено 3 параллельных эксперимента с различным временем культивирования на чашке Петри: 24, 48, 72 ч. В лунки вносили по 100 мкл суточного инокулята, инкубировали при 37 °С. После чего окрашивали среду 1% конго-красным, выдерживали 15 минут и смывали 1 М раствором NaCl. Оценкой наличия целлюлозолитической активности служил диаметр зоны просветления вокруг лунок.

Аналогичный эксперимент проводился для грибов родов Alternaria и Trichoderma с измененным диапазоном времени культивирования – от 24 до 168 ч.

Для проведения твердофазной ферментации (ТФФ) в колбы объемом 250 мл помещали по 25 г. подсолнечного шрота, доводили до влажности 40% дистиллированной водой, в качестве источника азота добавляли мочевину, закрывали фольгой и автоклавировали при температуре 121 °C на протяжении 20 мин.

Перед ТФФ микроорганизмы культивировали на жидкой питательной среде на основе подсолнечного шрота с добавлением эпина, разведение 10^-1. Бактерии рода Bacillus культивировали в течение 24 ч, при 37 °C, грибы родов Alternaria и Trichoderma – в течение 72 ч при температуре 30 °C. В каждую колбу добавляли по 1 мл полученного инокулята. После ферментации в образцах подсолнечного шрота определяли массовую долю сырой клетчатки (СК)

Результаты исследования и их обсуждение

Важным фактором, определяющим целлюлолитическую активность, является концентрация вносимого биорегулятора и время последующего культивирования. Результаты экспериментов с наилучшими показателями целлюлолитической активности – наибольшими диаметрами зон лизиса – представлены в таблице 2.

Наглядно данные таблицы, отражающие зависимость целлюлолитической активности от концентрации эпина, представлены на рисунках 1 –3.

Таблица 2.

Максимальная целлюлолитическая активность исследуемых штаммов, выявленная в эксперименте

Table 2.

The maximum cellulolytic activity of the strains studied, revealed in the experiment

Микроогранизм Microorganism	Диаметр зон лизиса, мм | The diameter of the lysis zones, mm
	Эпин | Appin	Гетероауксин Heteroauxin	Без стимулятора | Without stimulant
р. Bacillus	35 (48 ч.)	22,25 (48 ч.)	12,25
p. Alternaria	38,75 (168 ч.)	32,25 (144 ч.)	29
p. Trichoderma	40 (168 ч.)	38 (120 ч.)	30,25

Рисунок 1. Зависимость диаметра зон лизиса грибов рода Alternaria от концентрации эпина в питательной среде

Figure 1. Dependence of the lysis zones diameter of Alternaria on the concentration of appine in a culture medium

Рисунок 2. Зависимость диаметра зон лизиса грибов рода Trichoderma от концентрации эпина в питательной среде

Figure 2. Dependence of the lysis zones diameter of Trichoderma on the concentration of appine in a culture medium

Рисунок 3. Зависимость диаметра зон лизиса бактерий рода Bacillus от концентрации эпина в питательной среде

Figure 3. Dependence of the lysis zones diameter of Bacillus on the concentration of appine in a culture medium

Из выше представленных рисунков видно, что биорегулятор эпин в разведении 10^-1 проявил наибольшее усиление целлюлозолитической активности для бактерий рода Bacillus и грибов родов Alternaria и Trichoderma .

Далее была проведена твердофазная ферментация по схемам, продемонстрировавшим наибольшее усиление целлюлазной активности – максимальный диаметр зоны лизиса. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3.

Содержание сырой клетчатки при твердофазном культивировании с добавлением эпина

Table 3.

The content of crude fiber in solid-phase cultivation with the addition of appine

Микроогранизм | Microorganism	Содержание сырой клетчатки в подсолнечном шроте после ферментации | The content of raw fiber in sunflower meal after fermentation		Содержание сырой клетчатки в исходном подсолнечном шроте | The content of raw fiber in the initial sunflower meal
	Эпин, разведение 10-1 | Appine, dilution 10-1	Контроль | Control
Alternaria alternata	12,5	13,26	14,07
Trichoderma reesei	12,1	13,76
Bacillus subtilis	13,4	11,37

Заключение

Проанализировав полученные в ходе экспериментов данные можно сделать вывод о положительном влиянии биостимуляторов