Изучение влияния циклофосфана и соевых белков на рост перевиваемых опухолей мышей

INVESTIGATION OF CYCLOPHOSPHAN AND SOY-BEAN PROTEINS

ON THE GROWTH OF INTERWINED TUMOURS OF MICE

G.V.Kireev1, Yu. Yu. Assesorova1, A.A. Ysupova1, F.A. Ibragimov2, Z. Golubenko2

Republic oncological scientific centre of the Ministry of Public Health of Uzbekistan1, Tashkent

Institute of the bioorganic chemistry of SA Uzbekistan after name of academic A.S. Sadikov2, Tashkent

The influantion of new bioregulator on the basis of soy-been proteins on the growth of the experimental tumors of mice “sarcoma-180” and “melanoma B-16” was investigated. The results showed, that the soy-been proteins, using as the untitumor drug or the mean of additional therapy together cyclophosphan, allow to heighten the effect of experimental tumor therapy. By that the essential positive effect of the therapy is the tumor regression intensification, mice with tumor life-time prolongation and it depends of tumor gistogenesis. The action of cyclophosphan and soy-been proteins induces the expression in tumor cells de novo polypeptides with molecular weight 21, 36, 39, 44, 62 и 64 kDa.

Широкое внедрение в клиническую практику лекарственных методов лечения рака выдвинуло задачи изыскания новых путей и средств повышения реактивности больного, а также уменьшения токсичности антибластомных агентов при условии сохранения их активности. В этом плане представляет интерес поиск новых методов сочетанного действия противоопухолевых препаратов и различных средств биотерапии опухолей, которые могут привести, с одной стороны, к уменьшению токсических реакций организма, с другой, – к усилению регрессии опухоли. Лекарственные средства, используемые для биотерапии рака, в настоящее время весьма разнообразны. Это генные конструкции, биологически активные соединения, моноклональные антитела, природные и синтетические пептиды, низкомолекулярные вещества и др. [5, 7, 8, 9, 12].

Широкое применение как в экспериментальных, так и в клинических исследованиях находят средства природного происхождения, применяемые в качестве биорегуляторов и биологически активных добавок (БАД). В настоящее время изучены биологические свойства целого ряда биорегуляторов, которые сочетают противоопухолевую активность с другими позитивными фармакологическими эффектами, основанными на их антиоксидантной, детоксицирующей, иммуномодулирующей или противовоспалительной способности (препараты и биологически активные добавки «лапрот», «антиоксифит», «гераном», «кас-катол», «баксин», «инсол», «мелатонин», «вилон», «эпиталон» и др.) [3].

Анализ данных литературы и собственные предварительные исследования позволяют нам предположить, что природными биорегуляторами, способными проявлять противоопухолевые свойства и усиливать терапевтический эффект противоопухолевого лечения, могут являться белки, выделенные из плодов бобовых растений. Так, белковые ингибиторы протеаз, выделенные из соевых бобов и гороха, в несколько раз снижают частоту возникновения опухолей при воздействии канцерогенных агентов, усиливают регрессию опухоли и замедляют инвазию и метастазирование [1, 2]. Учитывая вышеизложенное, мы изучили влияние новой биологически активной добавки, содержащей фракцию соевых белков с молекулярной массой от 24 до 85 кДа, на рост экспериментальных опухолей различного гистогенеза при проведении химиотерапии циклофосфаном.

Известно, что рак связан с нарушением механизмов, контролирующих упорядоченную экспрессию генов в дифференцированных тканях [12]. Миспрог-раммирование генетической информации является общей фенотипической чертой опухолевых клеток, обусловливающей аберрантный синтез белков, которые могут быть эндогенными регуляторами, участвующими в контроле клеточной пролиферации, дифференцировке и гибели. В связи с этим мы сочли целесообразным провести сравнительную оценку экспрессии белков в опухолевых клетках при воздействии циклофосфана и соевых белков.

Цель исследования – оценка эффективности соевых белков как самостоятельного противоопухолевого средства и дополнительного, коррегирующего средства при лечении цитостатическим препаратом циклофосфаном животных с перевиваемыми опухолями «саркома-180» и «меланома В-16», а также изучение состава белков, экспрессируемых опухолевыми клетками данных штаммов.

Материалы и методы

В настоящей работе использовали мыши линии С57BL и белые беспородные разводки вивария опытно-экспериментального завода «Нихол» РОНЦ МЗ РУз весом 18–20 г. Животных содержали по 4–6 особей при естественном режиме освещения со свободным доступом к воде и пище. Взвесь опухолевых клеток (опухоли «саркома S-180» и «меланома В-16») в объеме 0,3 мл (1,2•10⁶ клеток) перевивали подкожно согласно методике [ 6 ] .

Соевый белок (СБ), представляющий собой сухой порошок белого цвета без запаха и примесей, получали путем фракционной экстракции и последующей гельфильтрации из шрота сои, после удаления масла и жиров. СБ вводили мышам в дозе 150 мг/кг перорально, через 48 ч после перевивки опухоли, в течение 10 дней. Циклофосфан вводили в дозе 20 мг/кг внутрибрюшинно, через 48 ч после перевивки опухоли, в течение 10 дней. Экспериментальных животных либо забивали на 14-й день эксперимента под хлороформенным наркозом, либо вели наблюдение до естественной гибели. Эффект противоопухолевого действия оценивали по массе (М) извлеченной опу- холевой ткани и средней продолжительности жизни (СПЖ). Торможение роста опухоли (ТРО) и увеличе- ние продолжительности жизни (УПЖ) животных вычисляли по формулам [3]:

ТРО = (Мопыт – Мконтроль) / Мопыт ∙ 100%.

УПЖ = (СПЖопыт – СПЖконтроль) / СПЖопыт ∙ 100%.

Экспериментальных животных разделили на 4 группы (по 6 мышей в каждой): I группа – конт- рольная, включавшая нелеченых животных-опухоле-носителей; II группа – животные-опухоленосители, получавшие циклофосфан; III группа – животные-опухоленосители, получавшие циклофосфан и соевый белок; IV группа – животные-опухоленосители, получавшие соевый белок.

Для выделения водорастворимых клеточных белков навеску опухоли массой 2 г измельчали в жидком азоте, гомогенезировали в 10% растворе NaCl, белки экстрагировали в этом же растворе 30 мин при 4⁰С. Гомогенат центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин для удаления клеточных обломков. Супернатант центрифугировали 20 мин при 6000 об/мин и температуре 4⁰С. Электрофорез белков проводили в 10 – 15 % полиакриламидного геля (ПААГ) по методу Laemmli [10]. Пластину ПААГ окрашивали кумаси-бриллиан-товый-синий-G-250.

Статистическая обработка результатов исследования проводилась по Стьюденту. Достоверность полученных результатов оценивали при доверительном интервале (p<0,05).

Результаты и обсуждение

Результаты проведенных исследований показали, что применение циклофосфана в указанной дозе тормозит рост опухоли «саркома-180» до 91 % по массе при достоверной разнице средней массы опухоли в данной группе по сравнению с контролем и увеличивает среднюю продолжительность жизни животных-опухоленосителей в 1,4 раза (табл. 1).

Воздействие на рост опухоли СБ совместно с цик-лофосфаном повышает эффективность противоопухолевого лечения: ТРО по массе составило 93 % (при достоверной разнице средней массы опухоли с конт-

Г.В. КИРЕЕВ, Ю.Ю. АССЕСОРОВА, А.А. ЮСУПОВА, Ф.А. ИБРАГИМОВ, З. ГОЛУБЕНКО

Таблица 1

Действие соевого белка и циклофосфана на рост опухоли «саркома S-180» (мыши белые беспородные)

Таблица 2

Действие соевого белка и циклофосфана на рост опухоли «меланома B-16», (мыши линии В₅₇BL)

Группы животных	ПрНИВрйЛЫ	Мата ОТ^ГОЩ. г.	ТЮ %	спж тай	таж %	Группы животных	Препараты	Масса опухоли, г.	ТРО %	СПЖ дней	УПЖ %
I грунт	1Ж1СУ мзЕпрють	утур			33&133	I группа	1,8±0,09 контроль	1,7±0,08		23,4±1,17
П ipyina	Циклэфосфан	Р,1Й±ДСО8	91,114,4	30^52	37,411^4	II группа	Циклофосфан	0,62±0,03	45,0±2,	35,4±1,72	51,28±2,6
Ш грунт	Циклэфсифан + СБ	3121QJOD6	93314,9	6^31326	■Д4±3?2	III группа	Циклофосфан + СБ	0,40±0,02	76,4±3,2	41,8±2,06	78,6±3,94
IV груши.	СБ	qiMyre	89,4Д14,4	5331231	53312,74	IV группа	СБ	1,02±0,05	40,0±1,9	30,6±1,53	30,7±1,53

(а)

Рис. 1. Действия циклофосфамида и соевого белка на массу опухоли «меланома В -16» (а) и «саркома S- 180» (б):

1 – группа контроля, 2 – группа животных, получавших циклофосфан, 3 – группа животных, получавших циклофосфан + СБ, 4 – группа животных, получавших СБ

Рис. 2. Электрофореграмма 10–15 % ПААГ в присутствии SDS белков «саркомы S-180» и «меланомы В-16» после воздействия циклофосфана и соевого белка: 1, 6 – циклофосфан, 2, 7 – циклофосфан +соевый белок, 3, 8 – соевый белок, 4, 9 – контроль, 5,10 – маркеры (БСА; Химотрипсиноагент)

Меланома ЬМО

<;qiE*DM £-/£0

ролем и недостоверной с группой II), СПЖ увеличилась в 1,8 раза по сравнению с контролем, а показатель УПЖ достиг 78 %.

Однако СБ, применявшиеся для лечения животных с опухолью «саркома S-180» как самостоятельный противоопухолевый препарат в дозе 150 мг/кг, также проявили высокую цитостатическую активность: ТРО по массе достигало 89 % при достоверной разнице средней массы опухоли в сравнении с контролем. Оценка влияния СБ на продолжительность жизни жи-вотных-опухоленостителей также показала биологически значимый эффект: УПЖ составило 54 %.

Результаты эксперимента, проведенного на животных с опухолью «меланома В-16», показали, что применение циклофосфана задерживает рост данной опухоли до 45 % при достоверной разнице средней массы опухоли с контролем (табл. 2). Средняя продолжительность жизни животных-опухоленосителей в данной группе в 1,5 раза больше, чем в контроле. Как и в случае «саркомы S-180», воздействие СБ усиливает противоопухолевый эффект циклофосфана: ТРО по массе составило 76 % при достоверной разнице средней массы опухоли как с контролем, так и с группой II; СПЖ увеличилась в 1,8 раза по сравнению с контролем, а показатель УПЖ составил 79 %. Самостоятельный же противоопухолевый эффект СБ, применявшихся для лечения опухоли «меланома В-16», оказался невысоким: ТРО по массе составило 40 %, СПЖ увеличилась всего в 1,3 раза по сравнению с контролем, а УПЖ не превышало 31 %. Однако эти данные позволяют с уверенностью сказать, что изучаемый биорегулятор не стимулирует роста опухоли «меланома В-16».

Исследование методом электрофореза в ПААГ спектра клеточных белков, выделенных из опухолей «саркома S-180» и «меланома В-16» (рис. 2), показало существенное различие в их составе. Этот факт не противоречит данным литературы, поскольку известно, что для опухолей различного гистогенеза характерны специфические изменения состава клеточных белков, затрагивающие в каждом случае молекулярную массу, структуру, функциональную активность и другие характеристики полипептидов.

Анализ электрофореграмм клеточных белков, выделенных из опухолей у животных, подвергавшихся воздействию как противоопухолевого цитостатика, так и соевых белков, также показал специфические изменения спектра экспрессируемых протеинов. В ответ на воздействие изучаемых веществ опухолевые клетки индуцировали специфические de novo белки. Так, при воздействии циклофосфана в опухоли «меланома В-16» индуцируется экспрессия полипептидов с мол. массой 62 кДа и 44 кДа, циклофосфа- на и соевых белков – полипептида в 44 кДа, и только соевых белков – полипептидов массой 44 кДа и 36 кДа. В клетках опухоли «саркома S-180» под влиянием циклофосфана экспрессируются полипептиды с мол. массой 64 кДа и 21 кДа; при воздействии цик-лофосфана и соевых белков – полипептиды в 64 кДа и 39 кДа, и только соевых белков – полипептида с мол-.массой 64 кД.

Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствует о том, что новая биологически активная добавка, содержащая соевые белки, не стимулирует роста опухолей, а обладает противоопухолевым действием. Дополнение противоопухолевого лечения соевыми белками позволяет повысить эффективность химиотерапии экспериментальных опухолей животных. При этом основной положительный эффект лечения проявляется в усилении регрессии опухоли, увеличении продолжительности жизни животных-опухоленосителей и зависит от гистогенеза опухоли. Модулирующая активность новой биологической добавки, на основании результатов данных экспериментов, может объясняться свойствами соевых белков индуцировать экспрессию de novo клеточных полипептидов, которые могут являться специфическими эндогенными регуляторами метаболических процессов, направленных на подавление активности и роста опухолевой клетки.

Выводы

• 1.    Применение соевых белков как противоопухолевого препарата при лечении животных с опухолями «саркома S-180» и «меланома В-16» способствует регрессии опухоли в 1,7–9,5 раза и в 1,3–1,5 раза увеличивает продолжительность жизни животных.

• 2.    Соевые белки, используемые как дополнительное средство при лечении циклофосфаном животных с опухолями «саркома S-180» и «меланома В-16», повышают противоопухолевый эффект лечения, увеличивая регрессию опухоли в 4,2–15 раз и продолжительность жизни животных – в 1,8 раза.

• 3.    Воздействие циклофосфана и соевых белков индуцирует экспрессию в опухолевых клетках de novo полипептидов с молекулярными массами 21, 36, 39, 44, 62 и 64 кДа.