Изучение влияния фемтосекундного лазерного излучения на организм теплокровных животных

В настоящее время для генерации сверхкоротких импульсов используют твердотельные лазеры на основе титан-сапфировых кристаллов (Ti:Sp, длина волны излучения ~ 800 нм), иттербиевых кристаллов (Yb, длина волны излучения ~ 1040 нм) и волоконные лазеры, в том числе лазеры на волокнах, легированных эрбием (Er, длина волны излучения ~ 1550 нм). Фемтосекундные волоконные лазеры используются в биологии и медицине при многофотонной микроскопии, оптической когерентной томографии и при ограниченной микрохирургии, например, на роговице глаза [5, 6]. Компактность, низкая стоимость и стабильность фемтосекундных волоконных лазеров предоставляет возможность иметь источник фемтосекундного лазерного излучения (ФСЛИ) без необходимости покупки дополнительного дорогостоящего и сложного оборудования [2].

Терапевтическое применение лазеров в медицине основано на действии низкоинтенсивного и низкоэнергетического излучения, когда уровни интенсивностей и доз излучения исключают возможность прямой тепловой деструкции биологических структур, однако вызывают модификацию клеток [3]. Недеструктивная модификация мембран лежит в основе наблюдаемых на общефизиологическом уровне эффектов биостимуляции. Преимущества лазерного излучения реализуется за счет хорошей его дозируемости, бесконтактности, бескровности и за счет этого абластичности, стерильности и дает возможности получать эффект на различной глубине.

Механизм воздействия ультракоротких лазеров, сочетающих высокую пиковую мощность (6 кВт) с малой длительностью импульса (100·10-15с), на живые структуры не изучен.

Ключевым моментом при этом является вопрос о первичном фотоакцепторе лазерного из-лучения.Одним из таких акцепторов может являться эндогенный кислород, который под действием света в определенных спектральных интервалах переходит в высокореактивную форму и, вступая в биохимические реакции с ближайшим биосубстратом, вызывает модификацию клеточных мембран.

В соответствии с вышеизложенным представляется актуальным оценить влияние ультракоротких импульсов на теплокровных животных. Целью нашего исследования было изучение влияния ФСЛИ с длиной волны 1550 нм на кровь и кожу здоровых мышей.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили белые нелинейные половозрелые мыши, которых облучали фемтосекундным (ФС) лазером при разных плотностях потока энергии.

В качестве источника излучения использовался ФС эрбиевый лазер, излучающий в ближнем инфракрасном диапазоне ( А =1550 нм) и работающий в импульсным режиме ( т _им п = 10040^-15с) с пиковой мощностью — 6 кВт, средней мощностью — 1,25 мВт, являющийся совместной разработкой Научного центра волоконной оптики РАН и Центра нанотехнологий Ульяновского государственного университета.

Животные экспериментальной группы подвергались десятикратному ежедневному лазерному облучению. При облучении фемтосекундным лазером средняя плотность потока энергии на ткань (энергетическая доза) за одну процедуру составляла 0,06 Дж/см2в течение 2,5 минут и 0,12 Дж/см2 в течение 5 минут. При этом облучение проходило в импульсном режиме при огромной пиковой интенсивности 1910,8 Вт/см. В первом случаем облучения суммарная плотность потока энергии ЛИ на ткань за курс составила 0,6 Дж/ см2, а во втором - 1,2 Дж/см2.

Для оценки системы “перекисное окисление липидов - антиоксиданты” (ПОЛ-АО) в эритроцитах и плазме крови определяли уровень малонового диальдегида (МДА) в тесте с тиобарби-туровой кислотой [1], а также активность ферментов системы антиоксидантной защиты (АОЗ): каталазы и глутатион-S-трансферазы (ГТ) [4].

После облучения проводили гистологическое исследование кожи мышей с облучаемого участка. Для этого кожные лоскуты фиксировали в 10% нейтральном формалине, обезвоживали в спиртах, заключали в парафин. Из парафиновых блоков изготавливали срезы толщиной 5-7 мкм, которые окрашивали гематоксилин-эозином.

Статистическая значимость полученных ре- зультатов оценивалась с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Различия между группами считали достоверными при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При облучении интактных мышей ФС лазером в дозах 0,6 и 1,2 Дж/см2 в эритроцитах статистически значимо возрастает уровень МДА. При этом резкое увеличение его (625,15 мкмоль/л против 408,97 мкмоль/л в контроле) при плотности потока энергии 0,6 Дж/см2 сменяется снижением при увеличении плотности потока энергиидо 1,2 Дж/см2 (475,00 мкмоль/л).

Динамика показателей активности антиоксидантных ферментов – каталазы и ГТ – в принципе была аналогичной: повышение при плотности потока энергии 0,6 Дж/см² и снижение при 1,2 Дж/см² (табл. 1). В плазме крови значимое изменения – снижение уровня МДА и возрастание активности каталазы – имело место только при плотности потока облучения 0,6 Дж/см² (табл.1). Уровень МДА при облучении в энергетической дозе 0,6 Дж/см² снижается более чем в 1,5 раза относительно контроля (5,64 + 0,71 против 9,4 + 2,22 в контроле).

Полученные результаты позволяют предполагать, что система ПОЛ-АО в эритроцитах мышей после облучения ФС лазером в используемых дозах переходит на более высокий уровень функционирования, это согласуется с данными предыдущих исследований [7]. Разнонаправленные изменения параметров системы ПОЛ-АО в плазме крови при ФСЛИ с плотностью потока энергии 0,6 Дж/см2 позволяют говорить о возможности возникновения оксидативного стресса.

Данные, полученные в результате гистологических исследований, указывают на то, что ФСЛИ может оказывать дозозависимое влияние на гистологические структуры кожи облучаемых животных.

Таблица 1. Активность антиоксидантных ферментов в эритроцитах и плазме крови мышей после воздействия разных доз ФСЛИ

Плотность потока энергии ФСЛИ Показатель	Без облучения	0,6 Дж/см2	1,2 Дж/см2
эритроциты
ГТ, ммоль/мин/л	0,326±0,065	0,602±0,06*	0,504±0,04*
Каталаза, мм оль/ми н/л	1,72±1,3	7,26±2,7*	6,27±1,24*
плазма крови
ГТ, м моль/мин/л	0,022±0,001	0,026±0,005	0,021±0,001
Каталаза, мм оль/ми н/л	0,9±0,12	1,88±0,62*	1,12±0,14

Примечание : * - данные, статистически значимо отличающиеся от данных без облучения, р <  0,05

Рис. 1. Контроль, общий план.

Окраска гематоксилин-эозином, увеличение 20х

Рис. 2. После облучения при плотности потока энергии 0,6 Дж/см².

Окраска гематоксилин-эозином, увеличение 20х.

В контрольных образцах эпидермис и дерма обычного гистологического строения. В подкожно-жировой клетчатке — слабая лимфоидно-лейкоцитарная инфильтрация с преобладанием нейтрофильных лейкоцитов (рис. 1). Облучение при плотности потока энергии 0,6 Дж/см2 приводит к утолщению эпидермиса и появлению гиперкератоза по поверхности. Дерма и подкожно-жировая клетчатка при этом обычного гистологического строения, без воспалительной инфильтрации (рис. 2). Облучение при плотности потока энергии 1,2 Дж/см2 приводит к утолщению эпидермиса и появлению гиперкератоза по поверхности. Дерма при этом умеренно утолщена за счёт разрастания плотной фиброзной ткани (очаги фиброзирования дермы), с сильной лимфоцитарной инфильтрацией (рис. 3).

Рис. 3. После облучения при плотности потока энергии 1,2 Дж/см².

Окраска гематоксилин-эозином, увеличение 20х.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ФСЛИ дозозависимо повышает активность компонентов системы ПОЛ-АО в эритроцитах облученных животных. Наиболее выраженные изменения наблюдаются при плотности потока облучения 0,6 Дж/см2. В плазме животных при 0,6 Дж/см2 отмечено снижение уровня продукта ПОЛ – малонового диальдегида – и повышение фермента, утилизирующего перекись водорода, – каталазы. Вероятно, система ПОЛ-АО эритроцитов более чувствительна к воздействию ФСЛИ. Таким образом, на основании полученных результатов, можно сделать вывод о том, что ФСЛИ изменяет уровень функционирования системы ПОЛ-АО крови лабораторных животных при облучении invivo,что может быть использовано для терапии в экспериментальной онкологии.

• 1.

• 2.

• 3.

• 4.

Работа поддержана Гос.заданием министерства образования и науки Российской Федерации.