Изучение влияния лецитина и глюкозы на ростовые свойства штаммов Streptococcus pneumoniae

Streptococcus pneumoniae (пневмококк) бессимптомно колонизирует носоглотку человека, у детей и иммунокомпрометированных лиц он способен являться причиной ряда тяжелых заболеваний: пневмония, менингит, бактериемия, средний отит и др. [Маянский и др., 2014; Brooks, Mias, 2018; Luck, Tettelin, Orihuela, 2020; Masomian et al., 2020; Agnew et al., 2022].

Бескапсульные формы и оптохинрезистентные изоляты S. pneumoniae , которые имеют значение в развитии пневмококковых инфекций, не всегда позволяют осуществить идентификацию с помощью существующих диагностических методов [Ing et al., 2012; Magomani et al., 2014; Keller, Robinson, McDaniel, 2016; Varghese, Jayaraman, Veeraraghavan, 2017; Chen et al., 2020; Jia et al., 2022;].

Использование видоспецифических антигенов S. pneumoniae является перспективным направлением для создания методов диагностики пневмококка. Одними из видоспецифических антигенов пневмококка являются уникальные по своей структуре тейхоевые кислоты (ТК) и липотейхоевые кислоты (ЛТК), которые могут рассматриваться в качестве кандидатов для создания диагностических средств [Denpaite et al., 2012; Сидоров, Поддубиков, 2021].

Пневмококк требователен к условиям культивирования [Лабораторная диагностика …, 2017; Oktari et al., 2019], поэтому было важным отобрать штамм, который способен расти в условиях искусственного выращивания без потери первоначальных биологических свойств, обладает стабильным ростом и отличается высоким уровнем выхода биомассы.

Известно, что рост и модификации клеточной стенки пневмококка зависят от холина [Maestro, Sanz, 2016; Bärland et al., 2022]. По данным литературы, фосфотидилхолин (лецитин) является поставщиком холина, и при внесении 0.01 г/л лецитина в питательный бульон происходит индукция размножения и экспрессия синтеза клеточных тейхоевых кислот пневмококка [Кветная, Железнова, 2014].

Исходя из литературных данных, S. mutans , выращенный в присутствии 0.5%-ного раствора глюкозы содержал повышенное количество ЛТК. Принимая во внимание тот факт, что глюкоза входит в состав повторяющихся цепей ТК и ЛТК пневмококка, в дальнейших экспериментах было важно оценить влияние глюкозы на ростовые свойства S. pneumoniae [Jacques et al., 1979].

Цель исследования – изучение влияния лецитина и глюкозы на ростовые свойства штаммов S. pneumoniae при выращивании клеток на полноценных питательных средах.

Объекты и методы исследования

Объектами исследования являлись штаммы S. pneumoniae : № 3405 (К-4), № 16082 (К-14), № 3391 (R-форма), полученные из Коллекции микроорганизмов III и IV групп патогенности ЦКП НИИВС им. И.И. Мечникова. Принадлежность использованных штаммов к виду S. pneumoniae подтверждали на основании исследования морфологических и культуральных свойств с помощью масс-спектрометрии с использованием прибора «MALDI Biotyper sirius RUO System» (Bruker, США). Для подтверждения серотиповой принадлежности применяли специфические пневмококковые антисыворотки (Statens Serum Institut, Дания).

Получение рабочих культур и оценку стабильности роста проводили путем проведения трех последовательных пассажей на кровяной агар с 5%-ным содержанием лошадиной дефибринированной крови (ЭКОлаб, Россия).

В качестве среды для культивирования использовали сердечно-мозговой бульон (Mast Group, Великобритания), в качестве дополнительных компонентов применяли глюкозу (Агат, Россия) или лецитин (AppliChem, Германия).

В ходе исследования были приготовлены три варианта питательной среды. В первые три контрольных флакона помещали 300 мл среды. В последующие три флакона добавляли 285 мл среды и 15 мл 10% глюкозы. В последние три флакона вносили 300 мл среды и 0.003 г лецитина. В каждый флакон вносили

1 мл бактериальной суспензии соответствующего штамма с показателем мутности 0.8 ед. МакФарланда (McF).

Штаммы культивировали в течение 24 ч. при температуре 37°C в инкубаторе с 5%-ным содержанием CO 2 и постоянным перемешиванием на шейкере «Elpan laboratory shaker type 358S» (Elpan, Польша). Каждый час в течение 10 ч. и по окончанию инкубации – 24 ч., производили оценку динамических показателей роста на приборе «Densi-La-Meter» (PLIVA-Lachema Diagnostika, Словакия).

По истечении 24 ч. инкубации образцы проверяли на микробиологическую чистоту путем посева 100 мкл из каждого флакона на кровяной агар с 5%-ным содержанием лошадиной дефибринированной крови с изучением фенотипических признаков. Идентификацию осуществляли с помощью MALDI TOF масс-спектрометрии. Оценку влияния добавления в среду культивирования глюкозы и лецитина на скорость и накопление биомассы различных штаммов S. pneumoniae выявляли путем сравнения показателя мутно-

сти исследуемых вариантов с контролем.

Кривые роста штамма Streptococcus pneumoniae W» 16082

0              1             10             11             zo

Чесы иниубации

• Кайерам -•■ Камерам * Слимы ■ ■ а ■ Каперам * Лащеем Кривые роста штамма Streptococcus pneumoniae W 3405

Чесы ННхуОации

Кривые роста штаммов S. pneumoniae.

Контроль — сердечно-мозговой бульон; * — р <0.01 по сравнению с контролем

[Growth curves of Streptococcus pneumoniae strains.

Staridart — Brain Heart Infusion Broth; * — p <0.01 compared to control]

Эксперимент по инкубированию штаммов был воспроизведён трижды. На основе полученных средних значений строили графики с кривыми роста для трех различных штаммов S. pneumoniae при культивировании в средах различного состава. Все данные подвергались статистическому анализу. Результаты обрабатывали с помощью стандартного программного пакета Microsoft Excel для Windows. Данные на графиках представляли как среднее (М) ± квадратичное отклонение (SD). Корреляционный анализ проведен с применением коэффициента t Стьюдента. Критический уровень значимости статистических различий принимали равным 0.01.

Результаты и их обсуждение

В результате оценки влияния добавления в среду культивирования глюкозы и лецитина на скорость и накопление биомассы различных штаммов S. pneumoniae было отмечено несколько основных моментов (рисунок). Штамм S. pneumoniae № 16082 (К-14) в присутствии глюкозы выходил на стационарную фазу при более высоком показателе мутности по сравнению с контролем и с вариантом с добавлением лецитина. При этом фаза стационарного роста была более продолжительной, в то время как два других варианта на момент 24 ч. уже находились в фазе отмирания. Увеличение биомассы на 64% происходило именно в варианте с добавлением глюкозы.

Для штамма S. pneumoniae № 3405 (К-4) более эффективным ростовым фактором оказался лецитин. Лецитин оказывал влияние на время роста и увеличивал накопление биомассы на 10%.

При культивировании штамма S. pneumoniae № 3391 (R-форма) происходило увеличение накопления биомассы на 37.5% при выращивании с лецитином. В присутствии лецитина заметно увеличивалась продолжительность стационарной фазы роста бактериальных клеток. Следует отметить, что на 24 ч. инкубации штамм не вступил в фазу отмирания в варианте с добавлением лецитина в отличие от двух других вариаций культивирования.

Исходя из полученных результатов, следует отметить, что лецитин и глюкоза по-разному влияли на рост штаммов пневмококка.

Заключение

Полученные результаты проведенных экспериментальных исследований показали, что наиболее перспективным и технологичным оказался штамм № 16082 (К-14). Штамм № 16082 (К-14) имел более стабильный рост в течение трех пассажей и во всех трех случаях идентифицировался с высоким коэффициентом достоверности («score value» 2>) при проведении MALDI-TOF масс-спектрометрии, отличался более высоким уровнем накопления биомассы, обладал наиболее плотным осадком биомассы.

В результате выполненной работы отобран штамм, определены оптимальный состав питательной среды и подходящие условия культивирования для получения более высокого выхода биомассы S. pneumoniae .