Изучение возможности использования нанодисперсии экстракта бересты в качестве адъюванта вакцинных препаратов

Разработка новых классов адъювантов является перспективным направлением современной иммунобиологической промышленности. Согласно последним исследованиям, адъюванты являются незаменимыми для развития В- и Т-клеточного ответа, стимулируя антиген-презентирующие клетки (в особенности, дендритные) на синтез ко-стимулирующих молекул, процессирование и презентацию антигенов, миграцию в лимфатические узлы, секретирование цитокинов. Таким образом, адъюванты способны не только вызывать мощный иммунный ответ на различные антигены, но и эффективно управлять им, избирательно воздействуя на Тх1 (клеточный иммунный ответ), Тх2 (гуморальный иммунный ответ), цитотоксический Т-клеточный ответ, а также стимулируя неспецифический иммунитет [1].

В последнее время проводятся интенсивные исследования тритерпеноидов лупанового ряда в качестве средств доставки лекарственных субстанций [3–6]. В МИТХТ им. М.В. Ломоносова А.П. Каплуном с соавт. создан носитель лекарственных и диагностических средств, на основе экстракта бересты в форме водной нанодисперсии. Разработанный носитель эффективно включает не только лекарственные средства, но и обладает выраженной биологической активностью: адаптогенной, антиоксидантной, иммуномодулирующей, противовирусной, противо-бактериальной [2, 7].

Цель исследования: изучить возможность использования нанодисперсии экстракта бересты (САНЧ) в качестве адъюванта вакцинных препаратов.

Материал и методы

Адъювантные свойства САНЧ изучали в опытах на животных на модели двух вакцинных препаратов: вакцины гепатита В и расщепленной вакцины против гриппа птиц (Split) на основе штамма H5N1 Nibrq-14 (А/Вьетнам/ 1194/2004), таблица 1.

Иммунизацию животных проводили по следующим схемам:

• 1.    Морским свинкам массой 350–400 г двукратно подкожно с интервалом 14 дней вводили вакцины гепатита В с различными адъювантами в объеме 0,5 мл (10 мкг HBsAg). На 14 и 28-й день после иммунизации в сыворотках морских свинок методом иммунофер-ментного анализа (ИФА) определяли антитела к поверхностному антигену вируса гепатита В.

• 2.    В эксперименте с гриппозными вакцинами использовали мышей линии BALB/c массой тела 10–13 г. Иммунизацию осуществляли следующим образом: в каждую из задних лапок мышей вводили по 100 мкл свежеприготовленных растворов (с адъювантами или без них) внутримышечно из расчета 0,5 мкг гемагглютинина на животное.

На 14-й день после иммунизации в сыворотках мышей методом ИФА определяли антитела к вирусу A/Вьет-нам/1194/2004 (H5N1) по стандартной методике. На 15-й день на базе Института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко проводили заражение мышей высокопатогенным H5N1 вирусом A/Курица/Курган/3/ 2005. С этой целью всех мышей маркировали и помещали в 50-литровый контейнер с подводящей и отводящей трубками. По первой трубке поступал аэрозоль вируса, полученный на ультразвуковом ингаляторе “Муссон” (Алтайский приборостроительный завод, Барнаул), вторая, отводящая, трубка выводилась на HEPA-фильтр. Содержание вирусных частиц в единице объема аэрозоля рассчитывали согласно методике А.В. Овчаренко и соавт. [8]. Расчетная доза вируса около 104 TCID50/мышь, что составляет более 100 LD50. Через один час после прекращения подачи аэрозоля каждую группу мышей помещали в отдельную клетку и наблюдали в течение 17 дней, отмечая ежедневно павших животных.

Результаты и обсуждение

Результаты испытания экспериментального адъюванта САНЧ в составе вакцины гепатита В представлены в таблице 2.

Из представленных данных видно, что после первой прививки СГТ в исследуемых группах животных практически не отличались. После второй прививки в группах животных, в которых использовался адъювант САНЧ наблюдался достоверно (p<0,05) более высокий уровень анти-HBs (примерно в 2 раза выше), чем в группе животных, иммунизированных коммерческой вакциной. При этом следует отметить тот факт, что снижение концентрации САНЧ в 10 раз (с 500 до 50 мкг) не оказывало влияния на иммуногенные свойства вакцины гепатита В: различия величин СГТ между сравниваемыми группами не существенны (p>0,05). Таким образом, было показано, что адъювантирующие свойства САНЧ проявляются в концен-

Таблица 1

Варианты композиций вакцинных препаратов использованных в эксперименте

Вариант №	HBsAg, мкг/мл	ГА**, мкг/мл	Al(OH)3, мкг/мл	САНЧ*, мкг/мл
1	20	-	500	-
2	20	-	-	50
3	20	-	-	500
4	–	2,5	-	-
5	-	2,5	-	420
6	–	2,5	-	42
7	-	2,5	420	-
8	–	2,5	42	-

Примечание: * – отрицательно заряженные частицы размерами около 100 нм, любезно предоставленные проф. А.П. Каплуном; ** – гемагглютинин.

Таблица 2

Результаты изучения иммуногенных свойств вакцины гепатита В с адъювантами различной природы

№ варианта	Количество препарата введенного одному животному	Средняя геометрическая титра (СГТ), мМЕ/мл
		1-я прививка	2-я прививка
1	Контроль (коммерческая вакцина гепатита В (10 мкг HBsAg + 250 мкг Al(OH)3)	16,3 [5,6–47,2]	718,7 [450,9–1145,5]
2	10 мкг HBsAg + 25 мкг САНЧ	16,4 [8,99–29,8]	1484,9* [809,7–2723,2]
3	10 мкг HBsAg + 250 мкг САНЧ	11,7 [5,2–26,3]	1500,3* [1057,96–2127,6]

Примечание: *различия средних величин существенные по сравнению с контролем.

трациях значительно меньших, чем широко используемый адъювант – гель гидроксида алюминия, обеспечивая высокий иммунный ответ на вакцину гепатита В.

В следующей серии экспериментов были изучены адъювантные свойства САНЧ в составе гриппозной Split-вакцины, результаты которых представлены в таблице 3.

Результаты ИФА показали, что из препаратов с адъювантами максимальный уровень антител обеспечила вакцинная композиция с высокой дозой САНЧ, затем гидроксидом алюминия и с низкой дозой САНЧ. При этом Split-вакцина (без адъюванта) обеспечила 57,9% защиту мышей, несмотря на то, что титр антител, определяемый в сыворотке крови, был низким (<20). Добавление к Split-вакцине в качестве адъюванта гидроокиси алюминия практически не повлияло на защитные свойства вакцины. Увеличению количества выживших мышей (максимально на 20%) способствовало применение в качестве адъюванта САНЧ в количестве 420 мкг/мл (вариант 5, табл. 1).

Таким образом, в отличие от геля гидроксида алюминия, композиции с которым сходны по протективной способности со Split-вакциной без адъюванта, адъюванты на основе САНЧ достоверно повышали как уровень антител, так и протективную активность вакцин.

Заключение

В модельных экспериментах было установлено, что нанодисперсия экстракта бересты обладает выраженными адъювантирующими свойствами. Экспериментальные вакцины на основе расщепленного вируса гриппа птиц H5N1 А/Вьетнам/1194/2004 и рекомбинантного HBsAg с применением адъюванта растительного происхождения по иммуногенности превосходили аналогичные вакцины с гелем гидроксида алюминия. Полученные результаты указывают на перспективность использования нанодисперсии экстракта бересты в качестве адъюванта вакцинных препаратов. Необходимо дальнейшее углубленное изучение свойств нового адъюванта.

Таблица 3

Результаты изучения протективных и иммуногенных свойств Split-вакцины в опытах на мышах с адъювантами различной природы

№ варианта	Количество препарата введенного одному животному	Титр антител к H5N1 в ИФА*	Количество мышей до/ после заражения (1-й день / 17-й день)	% выживших мышей после заражения
4	0,5 мкг ГА	<20	19/11	57,9
5	0,5 мкг ГА +
	84 мкг САНЧ	800	17/14	82,4
6	0,5 мкг ГА +
	8,4 мкг САНЧ	400	19/13	68,4
7	0,5 мкг ГА +
	84 мкг Al(OH)3	400	15/9	60,0
8	0,5 мкг ГА +
	8,4 мкг Al(OH)3	400	19/12	63,2
9	контроль**	<20	20/0	0

Примечание: * – единицы измерения – величина обратная разведению сыворотки; ** – фосфатный буферный раствор.