Изучение взаимодействия некоторых химических элементов с водорослями: проверка способности к биосорбции

Нарастающее загрязнение водоемов и водотоков делает необходимым активизацию поисков технологий очищения водной среды. Актуальным направлением в поисках новых экологических биотехнологий является изучение возможностей использовать биомассу различного происхождения для целей очищения воды. Исследуется способность биомассы сорбировать и тем самым удалять из водной среды токсичные загрязняющие вещества, в том числе тяжелые металлы. Активно изучается сорбция тяжелых металлов биомассой растительного происхождения, включая биомассу водорослей (He, Chen, 2014).

Изучение взаимодействий металлов с водорослями из экстремальных местообитаний (горячих источников) представляет интерес и для познания адаптаций к неблагоприятным экологическим условиям, и с точки зрения экологической биотехнологии (He, Chen, 2014). Данная работа представляет собой развитие этих исследований. Для изучения возможности сорбции металлов биомассой был использован ранее недостаточно изученный биологический объект – экстремофильная водоросль Galdieria sulphuraria (Galdieri) Merola.

Этот вид эукариотных водорослей обнаружен в экосистемах горячих источников (hot springs and geothermal habitats) с низкими значениями pН водной среды. Геном этой одноклеточной водоросли содержит гены устойчивой к повышенной температуре АТФазы (heat tolerant archael ATPases), гены мембранных белков для антипорта ионов натрия и водорода (halophilic sodium-proton antiporters), а также гены других уникальных ферментов, которые обеспечивают для этого организма возможность выживания в экстремальных экологических условиях (Schönknecht et al., 2013). Уникальные особенности этого вида водорослей охарактеризованы в (Minoda, 2015; Sethe-Burgie et al., 2014; Selvaratnam et. al., 2014; Allen, 1959; Os-troumov, 2011).

Вопросы сорбции химических элементов биомассой представляют интерес не только для биотехнологии, но и для биогеохимии. Основатель биогеохимии В.И. Вернадский подчеркивал большое значение научного анализа взаимодействий химических элементов с организмами в биосфере (Вернадский, 1926; Vernadsky, 1998; Добровольский, 2010).

В предыдущих работах нами исследовались вопросы биосорбции химических элементов образцами биомассы других водных организмов, а именно высших водных растений (Ostroumov, Kolesov, 2010; Johnson et. al. , 2011; Ostroumov, Shestako va, 2009) .

Целью проведенной работы было расширить круг изучаемых видов водных организмов и проверить, возможна ли биосорбция некоторых тяжелых металлов биомассой водорослей Galdieria sulphuraria , используя метод методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ИСП-МС) (ICP-MS ) (Лубкова и др., 2014). Наши эксперименты установили способность биомассы этих водорослей к биосорбции (иммобилизации) меди из водной среды.

МЕТОДЫ

• 2.1.    Выращивание водорослей с целью получения биомассы .

Культуру клеток красных водорослей Galdieria sulphuraria выращивали в среде Аллена (M. Allen) (Allen, 1959), в качалке (90 об/мин) при температуре 34°C при освещении белым светом (60 мкE/м2, фотопериод 10 ч свет: 14 ч темнота). Среду Аллена перед стерилизацией подкисляли серной кислотой до рН 2.6 .

Исходная концентрация клеток водорослей в культуральной среде составляла 1 миллион на 1 мл. Клетки водорослей осаждали из культуральной среды центрифугированием (режим центрифугирования: 4 тыс. об/мин, 15 минут).

Инкубация биомассы в водной среде с добавками металлов.

Инкубацию проводили 90 мин в водной среде с добавками металлов при 24 ° С. Для приготовления многоэлементного раствора для инкубации использовали бидистиллированную воду и аттестованные стандартные образцы (ГСО) растворов ионов металлов.

Раствор для инкубации приготовлен из следующих растворов ГСО: кадмий (Cd) (ГСО 7773), свинец (Pb) (ГСО 7778), кобальт (Co) (7784), никель (Ni) (ГСО 7785) –1мг/см3 в 1М азотной кислоте, медь (Cu ) – 10мг/см3 в 1М азотной кислоте (ГСО 8210), Zn – 1 мг/мл в 1М соляной кислоте (ГСО 7778 ). Cтронций вводился рассчитанной навеской карбоната стронция . Для нейтрализации избыточной кислотности использовали гидрокарбонат натрия. Окончательный рН раствора 2,4.

Расчетные концентрации металлов в растворе: цинк, медь, стронций – 2 мг/л; кобальт, никель – 0,2 мг/л, кадмий, свинец – 0,1 мг/л.

В полученном растворе содержание металлов анализировали методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ИСП-МС).

Результаты анализа:

Zn 2,17 ppm; Sr 1,89 ppm; Co 0,186 ppm; Ni 0,19 ppm; Cd 0,09 ppm; Cu 1,85 ppm; Pb 0,10 ppm.

Концентрации металлов были выбраны с учетом степени относительной токсичности металлов и возможного наличия этих металлов в загрязненной воде водных экосистем.

Пробоподготовка образцов для дальнейших измерений концентрации химических элементов.

В ходе проведения экспериментов получено четыре образца биомассы, которые были высушены до постоянного веса при 80 ° С в сушильном шкафу, а затем проведено озоление с добавкой двух капель концентрированной азотной кислоты сначала на плитке, а затем в муфеле (muffle) при 450 ° С в течение двух часов.

Полученная после озоления зола твердых образцов была переведена в раствор методом кислотного выщелачивания (acid leaching) (концентрированная HCl, концентрированная HNO3 и 1:1 H2SO4). Пробы после их разложения были перенесены в стерильные центрифужные мерные пробирки и доведены бидистиллирован-ной водой (характеристика бидистиллированной воды: 2,7 мкСм/см [2,7 микроСи-менс/см ]) до фиксированного объема.

Мортмасса. Использованы образцы мортмассы, полученные из биомассы путем высушивания до постоянного веса (температура 90 ° С, 4 ч). Перед высушиванием образцы хранились около 1,5 мес. в холодильнике при -15 ° С. Высушенные образцы имели вид темно-коричневой витрифицированной массы. Ее растирали пестиком в фарфоровой ступке в порошок перед проведением инкубации.

• 1.2.    Измерения методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ИСП-МС, ICP-MS).

Применявшийся в экспериментах метод измерения – метод масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ИСП-МС, ICP-MS) – описан ра- нее (Лубкова и др., 2014). Пробоподготовка описана выше. При подготовке растворов для анализа методом ИСП-МС было проведено разбавление по массе 3% азотной кислотой о.с.ч. и добавлен раствор индия (Indium ICP Standard CertiPUR 1002 мг/л +/-0,4%) в качестве внутреннего стандарта. Концентрация индия в каждой пробе составила 10 ppb. Измерения проводились с использованием масс-спектрометра высокого разрешения с индуктивно-связанной плазмой ELEMENT-2 фирмы Thermo Finnigan (Германия). Для калибровки прибора использовался муль-тиэлементный стандарт для ICP-MS (набор ICP-MS-68A, «High-Purity Standards», США).

Пределы обнаружения элементов рассчитывались как отношение минимальных интенсивностей к угловым коэффициентам калибровочных кривых. Измерения в каждой пробе делали 9 раз. Относительное стандартное отклонение (по результатам 9 анализов каждой пробы прибором ELEMENT-2) составило в среднем для Sr – 0,59%, Cu – 1,16%, Pb – 1,31%, Zn – 0,87%, Cd – 7,83%, Со – 1,68%, Ni – 5,64%.

Результаты измерений на масс-спектрометре высокого разрешения с индуктивно-связанной плазмой ELEMENT-2, полученные для растворов биомассы, были пересчитаны на содержание микроэлементов в сухом веществе с учетом разведения и массы высушенной и растворенной в кислоте биопробы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В результате проведенной работы были измерены концентрации нескольких химических элементов (металлов) в образцах биомассы изученных красных водорослей Galdieria sulphuraria, в том числе после инкубации этой биомассы в водной среде с добавками металлов.

Результаты измерения химических элементов в образцах термофильных красных водорослей, полученные с помощью метода ICP-MS, представлены в таблице.

Таблица

Содержание химических элементов в сухом веществе образцов Galdieria sulphuraria после и без инкубации, по результатам измерений методом ICP-MS

Измерения химических элементов проводили 9 раз, в таблице приведены средние значения. Относительное стандартное отклонение указано в методической части статьи.

Единицы измерения содержания элементов: ppm (мкг/г).

№	Образцы материала (водоросли Galdieria sulphuraria) , в которых измеряли содержание химических элементов	Zn	Sr	Cu	Co	Ni	Pb	Cd
1	Биомасса Galdieria sulphuraria после инкубации	12	0,29	7,0	7,4	0,49	0,54	менее 0,01
2	Биомасса без инкубации (контроль)	6	0,72	0,8	1,4	1,2	0,55	0,071
3	Мортмасса Galdieria sulphuraria после инкубации	23	3,0	5	0,32	0,28	менее 0,04	менее 0,01
4	Мортмасса без инкубации (контроль)	12	3,2	10	0,32	0,45	менее 0,04	менее 0,01

Из таблицы видно, что после инкубации концентрация цинка, меди и кобальта в биомассе значительно увеличилась. В мортмассе прироста концентрации этих элементов (иммобилизации) не наблюдалось. Иммобилизации никеля, свинца, кад 28

мия и стронция в биомассе или мортмассе не выявлено. Отметим, что отсутствие биосорбции этих металлов в условиях опыта еще не означает, что она в принципе невозможна на биомассе водорослей этого вида, если условия инкубации будут иными.

С точки зрения экологии представляется заслуживающим внимания то, что полученные результаты изм ерений доп олняют и д етализируют представления о многофунк циональном (multifunctional) участии живых организмов в детоксицирующей системе биосферы (Ostroumov, Shestakova, 2009; Остроумов и др., 2010; Ostroumov, 2011, 2012), а также конкретизируют положения теории биотического (биологического) самоочищения воды в водных экосистемах (Ostroumov, 2014).

Полученные результаты интересно сопоставить с данными экспериментов других авторов, проведенных на других биологических объектах (Sheng et. al., 2004; Romera et al., 2007; Sheng et. al., 2007; Mata et al., 2008; Kleinübing et al., 2011; Luna et al., 2012; Plaza Cazón, 2012).

Медь. Сорбция меди биомассой водорослей была показана на нескольких видах (Sheng et al., 2004, 2007; Romera et al., 2007, Kleinübing et al., 2011), в том числе: Sargassum sp. (Sheng et al., 2004; Sheng et. al., 2007; Kleinübing et al., 2011), Padina sp. (Sheng et al., 2004), Fucus spiralis (Romera et al., 2007), Ascophyllum nodosum (Romera et al., 2007). Показана сорбция свинца биомассой ряда видов водорослей, в том числе: Sargassum sp. (Sheng et al., 2004), Padina sp. (Sheng et. al., 2004), Fucus vesiculosus (Mata et al., 2008).

Цинк. Способность сорбировать цинк показана для биомассы следующих видов водорослей:

Sargassum sp. (Sheng et al., 2004);

Padina sp. (Sheng et al., 2004);

Fucus spiralis (Romera et al., 2007);

Ascophyllum nodosum ( Romera et al., 2007);

Sargassum filipendula (Luna et al., 2010);

Macrocystis pyrifera (Plaza Cazón et al., 2012).

Установлена биосорбция химических элементов на биогенном материале и других видов организмов (например: Ostroumov, Kolesov, 2010; Johnson et. al., 2011; Остроумов и др., 2012; He, Chen, 2014), а также (Sheng et. al., 2004; Fomina, Gadd, 2014).

Проведенные опыты выявили следующее. В условиях проведенной инкубации не было универсальной, тотальной биосорбции всех химических элементов, которые присутствовали в среде инкубации в повышенной концентрации (так, биосорбции никеля, свинца, кадмия и стронция в условиях опыта не наблюдали). Выявленные авторами отличия в поведении металлов и их совершенно различная подверженность биосорбции указывают на то, что существуют пока не известные нам индивидуальные особенности химических элементов в их взаимодействии с биомассой и мортмассой растительных организмов (на примере красной водоросли Galdieria sulphuraria ). Дальнейшие исследования и накопление дополнительной информации о биосорбции химических элементов биомассой различного происхождения поможет выяснить эти особенности.

ВЫВОДЫ

Вышеизложенные опыты и их анализ позволяют сделать следующие выводы.

• 1) . Впервые с помощью метода ICP MS изучена возможность биосорбции нескольких химических элементов (Zn, Co, Cu и др.) биомассой термофильной красной водоросли Galdieria sulphuraria. Выявлено, что биомасса термофильных водорослей этого вида иммобилизует указанные три металла после инкубации в водной среде с добавленными тяжелыми металлами. В водную среду инкубации биомассы добавляли также и стронций, никель, кадмий и свинец, но биосорбции этих элементов из водной среды в условиях опыта не обнаружено.

• 2) . При изучении витрифицированной мортмассы красной водоросли Galdieria sulphuraria методом ICP MS было показано, что в условиях эксперимента не наблюдалось сорбции на этой мортмассе изучавшихся элементов.

• 3) . Полученные результаты измерений дополняют и детализируют положения теории биотического (биологического) самоочищения воды в водных экосистемах (Ostroumov, 2014).

• 4) . Представляет теоретический и практический интерес то, что при биосорбции из водной среды происходит частичная иммобилизация сорбированных химических элементов, снижается их подвижность по сравнению в ионами металлов, находящимися в водной фазе. Поэтому новые факты об биосорбции металлов (на примере цинка, кобальта, меди) биомассой водорослей (в том числе на примере водоросли Galdieria sulphuraria ) вносят вклад в разработку вопросов биотехнологии (Fomina, Gadd, 2014), биогеохимии и химических аспектов жизни биосферы (Вернадский, 1926; Vernadsky, 1928; Остроумов, 2003, 2012; Добровольский, 2007), вопросов экологической безопасности.

• 5) . Результаты опытов показывают резко различающийся, дифференциальный характер биосорбции различных металлов на биомассе одного и того же вида организмов. Установлены примеры различающейся способности к сорбции живой и высушенной (витрифицированной) биомассы водорослей Galdieria sulphuraria. Резкие различия в поведении нескольких металлов при сорбции на биомассе усложняют понимание роли водной биоты (водных организмов) в судьбе ионов металлов в водной фазе водных экосистем, что делает необходимыми дальнейшие исследования.

Авторы благодарят коллег за советы и рекомендации. Благодарность приносится участникам научной сессии памяти В.И.Вернадского, организованной Институтом экологии Волжского бассейна РАН, за обсуждение вопросов биогеохимии.