Изучение взаимосвязи мутаций гена KRAS у больных колоректальным раком в зависимости от пола, возраста и расы в популяции Республики Казахстан

Колоректальный рак (КРР) является одним из наиболее распространенных онкологических заболеваний в мире и занимает 3-е место в структуре смертности от злокачественных новообразований [1]. Ежегодно в мире регистрируется около 1 361 000 новых случаев КРР и около 694 600 пациентов погибают от данной патологии. В экономически развитых странах на колоректальный рак приходится примерно 9–14 % случаев онкологических заболеваний. В 2016 г. в Республике Казахстан зарегистрировано 3 158 больных КРР, умерло 1 484 человек. В структуре смертности рак прямой кишки и рак ободочной кишки заняли 8-е и 5-е ранговые места соответственно [2].

В настоящее время доказано, что в основе механизмов развития злокачественных опухолей, в том числе и рака толстой кишки, лежат соматические генетические повреждения. Одним из наиболее значимых событий в молекулярном патогенезе КРР является активирующая мутация в онкогене KRAS . В последнее время в разных странах активно проводятся исследования по определению мутации гена KRAS и анализ ее взаимосвязи с клиническим течением КРР. В частности, было достоверно установлено, что опухоли с мутацией KRAS практически не отвечают на терапию ингибиторами рецептора эпидермального фактора роста (epidermal growth factor receptor, EGFR) [3]. Большинство мутаций, приводящих к активации KRAS , находятся в экзонах 12 и 13. Любая из шести мутаций двенадцатого кодона (gly12asp, gly12ala, gly12arg, gly12val, gly12ser, gly12cys) и одна мутация тринадцатого кодона (gly13asp) коррелируют с резистентностью опухолей мКРР к моноклональным антителам (МКА) рецепторов эпидермального фактора роста (EGFR).

Влияние пола и возраста на статус гена KRAS при КРР остается предметом для дискуссий. Имеются отдельные указания на связь мутации гена KRAS с курением, однако эти наблюдения также требуют подтверждающих исследований [4–7]. Таким образом, можно думать о том, что, возможно, этнические и географические особенности оказывают свое влияние на генез КРР, чем и может объясняться подобное различие.

Учитывая многонациональность населения Республики Казахстан, представляется интересным выяснить особенности КРР в зависимости от пола, возраста и расы при наличии или отсутствии мутации гена KRAS.

Целью исследования явилось изучение зависимости статуса гена KRAS от пола, возраста, расы у больных КРР в Республике Казахстан.

Материал и методы

Изучены данные 332 больных колоректальным раком, зарегистрированных в Республике Казахстан с 2010 по 2014 г. У всех пациентов диагноз рака ободочной и прямой кишки был морфологически подтвержден.

При анализе распределения больных по полу установлено, что женщин было несколько больше, чем мужчин, – 182 (54,8 %) и 150 (45,2 %) соответственно (табл. 1). Преобладали пациенты, относящиеся к европейской расе, – 170 (51,2 %), против 162 (48,8 %) больных, относящихся к азиатской. Основное число больных находилось в возрасте 44 лет и старше (более 80 %) и только около 10,5 % были моложе 44 лет (табл. 1). Средний возраст пациентов на момент лечения составил 56,4 ± 10,5 лет (от 25 до 79 лет).

Молекулярно-генетические исследования по определению статуса гена KRAS по послеоперационному и/или биопсийному материалу пациентов с

КРР проводились в лаборатории патоморфологии и молекулярной генетики Казахского НИИ онкологии и радиологии. Экстракцию ДНК проводили, используя наборы FFPE DNA extraction kit, Qiagen. Концентрацию экстрагированной ДНК определяли на спектрофотометре NanoDrop, а качество ДНК оценивали с помощью постановки контрольной ПЦР в режиме реального времени, сравнивая с контрольной ДНК. KRAS-тест проводили, используя наборы BioLink для выявления мутаций в 12 и 13 кодонах экзона 2, аллель-специфичным ПЦР методом.

Статистическая обработка материала производилась при помощи программы математической обработки данных с помощью пакета IBM SPSS Statistics 20 (trial-версия). Для выявления взаимосвязи между переменными использовался коэффициент линейной корреляции Пирсона (rp).

Результаты

Из 332 больных КРР, включенных в исследование, мутации гена KRAS были выявлены у 149 (44,9 %), тогда как немутированный («дикий») тип определялся у 183 (55,1 %) пациентов. Из 149

Таблица 1/table 1

Демографическая характеристика пациентов с КРР Demographic characteristics of patients with colorectal cancer

Количество больных/ Number of patients

Возраст, лет/ Age, years

Параметр/Parameter

Пол/Sex	Муж/Male Жен/Female	150 (45,2 %) 182 (54,8 %)
Раса/Race	Азиатская/Asian	162 (48,8 %)
	Европейская/European	170 (51,2 %)

25–43

44–59

60–74

35 (10,5 %)

169 (50,9 %)

118 (35,5 %)

75–89

10 (3,0 %)

Распределение мутаций в 12-м и 13-м кодонах гена KRAS

Distribution of mutations in the 12th and 13th codons of the KRAS gene

Таблица 2/table 2

Кодон/ Codon	Кодирование мутации/ Mutation coding	Замена аминокислоты/ Amino acid replacement	Соотношение/ Ratio
12	G12A	Gly12Ala	20 (13,4 %)
12	G12C	Gly12Cys	7 (4,7 %)
12	G12D	Gly12Asp	48 (32,2 %)
12	G12S	Gly12Ser	8 (5,4 %)
12	G12V	Gly12Val	37 (24,8 %)
13	G13D	Gly13Asp	29 (19,5 %)

Примечания: G12A, G12С, G12D, G12S, G12V, G13D (G – глицин, A – аланин, C – цистеин, D – аспартат, S – серин, V – валин; 12, 13 – положение аминокислоты в белке).

Notes: G12A, G12C, G12D, G12S, G12V, G13D (G – glycine, A – alanine, C –cysteine, D – aspartate, S – serine, V – valine; 12, 13 – the position of the amino acid in the protein).

Таблица 3/table 3

Частота мутаций KRAS в зависимости от пола association of gender with the frequency of KRAS mutation

Пол/Sex G12A G12С Мутации гена KRAS/KRAS mutations G12D G12S G12V G13D Всего/Total Мужской/ Male 9 (14,1 %) 2 (3,1 %) 23 (35,9 %) 1 (1,6 %) 15 (23,4 %) 14 (21,9 %) 64 (42,9 %) Женский/ Female 11 (12,9 %) 5 (5,9 %) 25 (29,4 %) 7 (8,2 %) 22 (25,9 %) 15 (17,6 %) 85 (57 %) Итого/Total 20 (13,4 %) 7 (4,7 %) 48 (32,2 %) 8 (5,4 %) 37 (24,8 %) 29 (19,5 %) 149 (100 %) мутаций – 120 (80,5 %) обнаруживались в кодоне 12. В 29 (19,5 %) опухолевых образцах мутации выявились в 13 кодоне (табл. 2).

Также была проанализирована частота замены аминокислот в каждом из исследованных кодонов. Из выявленных 120 мутаций в кодоне 12 наиболее часто обнаруживались мутации G12D – 32,2 %, следующими по частоте была мутации G12V – 24,8 % и G13D – 19,5 %. Мутации в G12C и G12S были достаточно редким событием и встречались в 4,7 % и 5,4 % случаев соответственно (табл. 2).

По статусу KRAS у пациентов обоих полов преобладал дикий тип: среди мужчин он встречался у 86 (57 %) пациентов, среди женщин – у 97 (53 %). Мутация данного гена наблюдалась у мужчин в 43 % случаев, а у женщин – в 47 %.

Из 85 мутаций, наблюдаемых у женщин, в кодоне 12 мутация была выявлена в 70 (82,4 %), в кодоне 13 – в 15 (17,6 %) случаях. У мужчин мутации в кодоне 12 были выявлены в 50 (78,1%), в кодоне 13 – в 14 (21,9 %) случаях. При анализе частоты мутации гена KRAS выявлено, что среди обоих полов чаще наблюдалась мутация G12D – 48, из них у мужчин – в 23 (47,9 %), у женщины – в 5 (52,1 %) случаях. Мутация G12V выявлена у 37 пациентов, из них у мужчин – в 15 (40,5 %), у женщин – в 22 (59,5 %) случаях. В 13 кодоне мутация G13D наблюдалась у 29 пациентов, из них у мужчин – в 14 (48,3 %), у женщин – в 15 (51,7 %) случаях. Наиболее редкие мутации – G12C, которые встречались у обоих полов менее чем в 5 % случаев (табл. 3).

Таким образом, частота мутаций гена семейства RAS в исследуемых кодонах среди женщин и мужчин не имела значимых различий. Отмечена статистически незначимая тенденция к увеличе- нию частоты мутации у женщин. Для пары «женщины – KRAS мутации» значение коэффициента корреляции rp=0,04, р=0,06. Отмечена прямая связь очень слабой силы между этими переменными (табл. 4).

При анализе распределения мутаций гена KRAS в зависимости от расовой принадлежности больных КРР установлено, что из 162 пациентов, относящихся к азиатской расе, дикий тип гена KRAS выявлен у 94 (51,4 %), мутированный – у 68 (45,6 %). У пациентов европейской расы дикий тип встречался в 89 (48,6 %), мутированный – в 81 (54,4 %) случае.

Мы попытались изучить частоту мутации в 12 и 13 кодонах гена KRAS у пациентов различных расовых принадлежностей. При этом из 68 пациентов азиатской группы мутации KRAS в кодоне 12 выявлены в 53 (77,9 %) случаях, в кодоне 13 – в 15 (22,1 %) наблюдениях. У пациентов европейской национальности мутации в кодоне 12 выявлены в 67 (82,7 %) случаях, в кодоне 13 – в 14 (17,3 %).

При анализе частоты мутации гена KRAS в различных кодонах выявлено, что у европейцев в 2 раза чаще (40,7 %) выявлялась мутация G12D, т.е. замена глицина на аспартат, по сравнению с больными азиатской национальности (22,1 %). Напротив, у азиатов чаще (36,8 %) наблюдалась мутация в G12V (замена на аминокислоту – валин), чем у европейцев, – 14,8 %. Замена на аспартат в 13 кодоне (G13D) встречалась с одинаковой частотой – в 14 и 15 случаях соответственно. Частота других мутаций среди азиатов и европейцев была примерно одинакова (табл. 5).

Анализ зависимости мутации от расы пациентов выявил некоторые преобладания мутации гена KRAS у европейцев – 81 (54,4 %) пациент. Иссле-

Таблица 4/table 4

Корреляция мутаций гена KRAS в зависимости от пола

Correlation of KRAS mutations with gender

KRAS статус/ KRAS status	G12A	G12С	G12D	G12S	G12V	G13D	Все мутации/ All mutations
r	0,042	0,034	0,054	0,025	0,032	0,049	0,04
Пол/Gender        p
p-value	0,06	0,06	0,06	0,06	0,06	0,06	0,06

Таблица 5/table 5

Частота мутаций KRAS в зависимости от расовой принадлежности association of race with the frequency of KRAS mutation

Расы/Race G12A Мутации гена KRAS/KRAS mutations Всего/ Total Дикий тип/ Wild-type G12С G12D G12S G12V G13D Азиатская/ 9 2 15 2 25 15 68 94 Asian (13,2 %) (2,9 %) (22,1 %) (2,9 %) (36,8 %) (22,1 %) (45,6 %) (51,4 %) Европейская/ European 11 5 33 6 12 14 81 89 (13,6 %) (6,2 %) (40,7 %) (7,4 %) (14,8 %) (17,3 %) (54,4 %) (48,6 %) дование зависимости типа мутации гена KRAS от расовой принадлежности выявило тенденцию к увеличению частоты мутации G12D у европейцев и G12V у азиатов (табл. 5). При корреляционном анализе отмечена статистически незначимая тенденция к увеличению частоты мутации у пациентов европейской расы. Для пары «европейская раса – KRAS мутации» значение коэффициента корреляции rp=0,057, р=0,06. Отмечена прямая связь очень слабой силы между этими переменными (табл. 6).

Распределение больных по возрастам проведено согласно классификации ВОЗ, в которой установлены следующие современные возрастные рамки: 25–44 года – молодой возраст; 44–60 лет – средний возраст; 60–75 лет – пожилой возраст; 75–90 лет – старческий возраст; после 90 лет – долгожители. Средний возраст пациентов на момент анализа составил 56,4 ± 10,5 года. Большинство больных были старше 44 лет – более 80 %, и только около 12 % находилось в возрасте до 44 лет. Из 36 больных в возрасте 25–43 года дикий тип гена KRAS встречался у 23 (63,9 %), мутированный ген – у 13 (36,1 %) пациентов. Среди 171 больного в возрасте 44–59 лет также превалировал дикий тип – 99 (57,9 %), мутированный ген KRAS наблюдался в 72 (42,1 %) случаях. У 125 больных в возрасте 60 лет и старше чаще выявлялся мутированный тип гена (табл. 7). При изучении частоты дикого типа гена KRAS в двух группах больных в возрасте 25–59 лет (1-я группа, n=122) и 60–89 лет (2-я группа, n=61) показано, что у пациентов 1 группы значимо чаще встречался дикий тип (0,05<р<0,10) (табл. 8).

Средний возраст больных с мутацией с диким типом гена KRAS существенно не отличался, составляя 57,4 ± 4,05 и 55,6 ± 3,6 года соответственно. Тем не менее частота мутаций в различных

Таблица 6/table 6

Корреляция мутаций гена KRAS в зависимости от расы

Correlation of KRAS mutation with race

KRAS статус/ KRAS status	G12A	G12С	G12D	G12S	G12V	G13D	Все мутации/ All mutations
Раса/Race          p	0,055	0,049	0,007	0,046	0,107	0,066	0,057
p-value	0,06	0,06	0,06	0,06	0,05	0,06	0,06

Таблица 7/table 7

Характеристика больных по возрастам и статусу KRAS

Characteristics of patients stratified by age and KRAS status

Возраст/Age                   Дикий тип/Wild-type                Мутированный тип/Mutated type

25–43 лет/years (n=36)	23 (63,9 ± 8,0 %)	13 (36,1 ± 8,0 %)
44–59 лет/years (n=171)	99 (57,9 ± 3,8 %)	72 (42,1 ± 3,8 %)
60–74 лет/years (n=114)	56 (49,1 ± 4,7 %)	58 (50,9 ± 4,7 %)
75–89 лет/years (n=11)	5 (45,5 ± 15,0 %)	6 (54,5 ± 15,0 %)
Всего/Total (n=332)	183 (55,1 %)	149 (44,9 %)

Таблица 8/table 8

Изучение частоты встречаемости дикого типа гена KRAS у больных колоректальным раком Frequency of wild-type KRAS in colorectal cancer patients

Группы больных/	Всего больных/	Дикий тип/
Groups of patients	Total number of patients	Wild-type
1 группа (29–59 лет)/	207	122
I group (29–59 years)		(58,9 ± 3,4 %)
2 группа (60–89 лет)/	125	61
2 group (60–89 years)		(48,8 ± 4,4 %)

Таблица 9/table 9

Корреляция мутаций гена KRAS в зависимости от возраста

Correlation of KRAS mutations with age

KRAS статус/ KRAS status	G12A	G12С	G12D	G12S	G12V	G13D	Все мутации/ All mutations
Возраст/         r p	-0,089	-0,08	-0,09	-0,083	-0,096	-0,08	-0,087
Age        p-value	0,06	0,06	0,06	0,06	0,05	0,06	0,06

Рис. 1. Спектр мутации гена KRAЅ в зависимости от возраста Fig. 1. KRAЅ mutation spectrum with respect to age

кодонах в зависимости от возрастных групп несколько варьировала. Все 6 типов мутации в 12, 13 кодонах встречались во всех возрастных группах. Максимальная частота мутаций наблюдалась у пациентов в возрасте ≥40 лет (n=135). Также довольно высокая частота мутации отмечена среди больных старше 50 лет (n=117).

Среди всех возрастных групп наиболее частой мутацией в опухоли была G12D 48 (32,2 %), т.е. замена глицина на аспартат. Следующими по частоте были мутация G12V – в 37 (24,8 %) и G13D – в 29 (19,5 %) случаях. Мутация G12С выявлена у 7 (4,7 %) пациентов в возрастной группе 44–59 и 60– 74 лет. Среди больных молодого возраста (25–43 года) и пожилых пациентов (75–89 лет) мутации G12С и G12S не были обнаружены (рис. 1).

При определении корреляционной связи мутации гена KRAS отмечена статистически незначимая тенденция к увеличению частоты мутации у пациентов до 60 лет. Для пары «возраст до 60 лет – KRAS мутации» значение коэффициента корреляции r_p =-0,087, р = 0,06. Отмечена обратная связь очень слабой силы между этими переменными (табл. 9).

Обсуждение

Согласно современным данным, около трети всех злокачественных новообразований ассоциированы с мутациями в генах семейства RAS. Однако частота мутаций этих генов значительно варьирует в зависимости от типа злокачественной опухоли, активирующие мутации KRAS часто обнаруживаются при немелкоклеточном раке легкого (15–20 %), раке толстой кишки (40 %) и аденокарциноме поджелудочной железы (95 %)

В проведенном исследовании впервые определена частота мутаций гена KRAS у пациентов с КРР в Республике Казахстан (44,9 %), которая близка по своему значению к международному уровню (~40 %). Частота мутаций в исследуемых кодонах среди женщин и мужчин была одинаковой.

Анализ зависимости типа мутации гена семейства KRAS от пола больных также не выявил значимых различий. Анализ зависимости мутации от расы пациентов выявил некоторое преобладание дикого типа у азиатской группы – 94 (51,4 %), тогда как у европейцев чаще выявлялась мутация гена KRAS – в 81 (54,4 %) случае. Зависимость типа мутации гена KRAS от расовой принадлежности выявила тенденцию к увеличению частоты мутации G12D и G12V в 12 кодоне.

Известно, что частота молекулярно-генетических и эпигенетических изменений увеличивается с возрастом. Также очень высока вероятность обнаружения мутаций в гене KRAS (12, 13 кодоны) у пациентов старше 55 лет (более чем на 50 %). В рамках исследования установлено, что мутации гена KRAS чаще наблюдались у пациентов старшего возраста – в 52,7 % случаев, по сравнению с диким типом KRAS – 47,3 %, что согласуется с данными исследователей других стран. При изучении частоты встречаемости дикого типа KRAS в двух группах больных – в возрасте 25–59 и 60–89 лет – было показано, что у групп пациентов молодого возраста значимо чаще встречался дикий тип (0,05<р<0,10).

Заключение

Таким образом, проведенное исследование по определению гена KRAS у больных КРР позволило выявить, что по статусу KRAS у пациентов обоих полов преобладал дикий тип: у мужчин он отмечен в 57 %, у женщин – в 53 % случаев. При анализе частоты мутации гена KRAS установлено, что независимо от пола чаще наблюдалась мутация гена G12 D. Наиболее редкими мутациями были G12C и G12S, которые встречались менее чем в 5 % случаев у больных обоего пола. Частота мутации в исследуемых кодонах среди мужчин и женщин была одинаковой. Анализ по изучению зависимости типа мутации гена KRAS от пола не показал значимых различий. Отмечена тенденция к увели- чению частоты мутации у женщин. Для пары «женщины – KRAS мутации» значение коэффициента корреляции rp=0,04, p=0,06. Анализ зависимости мутации от расовой принадлежности пациентов выявил некоторое преобладание дикого типа у азиатской группы, в то время как среди европейцев чаще выявлялась мутация гена KRAS. Различия статистически не значимы, при корреляционном анализе отмечена лишь тенденция к увеличению