Ядрышковые организаторы в Ki-67 позитивных клетках плоскоклеточного рака легкого: клинико-морфологические параллели и выживаемость

Изучение морфологических критериев, связанных с важнейшими клинико-морфологическими параметрами плоскоклеточного рака легкого и прогнозом течения заболевания, является актуальным [1]. Пролиферация – основополагающий процесс возникновения и развития опухоли, а также фактор прогноза. Существуют определенные трудности в оценке пролиферативного потенциала опухоли, так как он включает в себя не только количество пролиферирующих клеток, но и скорость прохождения клеткой фаз митоза (продолжительность клеточного цикла). Принятым критерием оценки пролиферативной активности является иммуногистохимическое определение антигена Ki-67. Антиген Ki-67 выявляется в клетках в G1-, S-, G2-, М-фазы, однако функциональное значение этого ядерного белка в процессе пролиферации до конца не известно [11]. Аргирофильные белки, ассоциированные с ядрышкообразующими районами (Ag-ЯОР-белки), являются маркером скорости клеточного цикла. До 75 % окрашивания Ag-ЯОР-белков составляют два главных аргирофильных белка – С23 (нуклеолин) и В23 (нуклеофозмин), – играющих важнейшую роль в синтезе рибосомальной РНК. Эти белки выявляются в ядрах клеток на протяжении всего клеточного цикла, количественно увеличиваясь в 1,5–3 раза в S- и G2-фазы [12]. Показана обратная зависимость между Ag-ЯОР-белками, длительностью клеточного цикла

• [6]    и временем удвоения плоскоклеточного рака легкого [3].

Предложен метод двойного окрашивания на антиген Ki-67 и Ag-ЯОР-белки, позволяющий оценивать активность ядрышковых организаторов (продолжительность клеточного цикла) в пролиферирующих клетках [9]. Работ, посвященных исследованию пролиферативного потенциала опухоли с использованием двойного окрашивания на антиген Ki-67 и Ag-ЯОР-белки, немного [4, 5, 7, 8, 14, 16]. Отсутствуют работы, в которых результаты двойного окрашивания на антиген Ki-67 и Ag-ЯОР-белки оцениваются с использованием компьютерного анализа изображений и во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами и выживаемостью при плоскоклеточном раке легкого.

Цель исследования – изучение Ag-ЯОР-белков в Ki-67 позитивных клетках во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами и выживаемостью при плоскоклеточном раке легкого.

Материал и методы

Исследованы 113 образцов плоскоклеточного рака легкого, полученных при операциях в Алтайском краевом онкологическом диспансере за период 2007–2009 гг. (случаи с отдаленными метастазами и множественными опухолями исключены из исследования). Средний возраст пациентов

таблица

Площадь ag-яОр-белков в Ki-67 позитивных клетках (в мкм2) при плоскоклеточном раке легкого

Характеристика Кол-во случаев Площадь Ag-ЯОР-белков в Ki-67 позитивных клетках Первичная опухоль 1. Т1 24 (21 %) 9,53 ± 2,42 (р1–2=0,1) 2. Т2 72 (64 %) 10,54 ± 2,73 (р1–3<0,001) 3. Т3 17 (15 %) 12,79 ± 2,41 (р 2–3=0,003) Размер первичной опухоли 4. <3 см 44 (39 %) 9,46 ± 2,60 5. >3 см 69 (61 %) 11,44 ± 2,63 (р4–5<0,001) Лимфатические узлы 6. N0 72 (64 %) 9,96 ± 2,58 7. N1–3 41 (36 %) 11,91 ± 2,70 (р6–7<0,001) Стадия опухолевого процесса 8. I 56 (50 %) 9,83 ± 2,64 (р8–9=0,058) 9. II 39 (34 %) 10,92 ± 2,61 (р8–10<0,001) 10. III 18 (16 %) 12,71 ± 2,51 (р9–10=0,02) Дифференцировка опухоли 11. Высокая 38 (34 %) 9,70 ± 2,61 (р11–12=0,04) 12. Умеренная 52 (46 %) 10,82 ± 2,60 (р11–13=0,007) 13. Низкая 23 (20 %) 11,93 ± 2,97 (р12–13=0,1) составил 59 лет (40–75 лет), из них – 109 (96 %) мужчин и 4 (4 %) женщины. Больным выполнены 69 (61 %) лобэктомий и 44 (39 %) пневмонэктомии. Предоперационная химиотерапия и лучевая терапия не проводились. Патогистологическая характеристика опухолей определена согласно классификации TNM 7-го пересмотра [13] и представлена в таблице.

Из парафиновых блоков забраны столбики ткани иглой-панчером с внутренним диаметром 1,5 мм, на основании просмотра соответствующих гистологических препаратов. Для исключения гетерогенности окрашивания изготовлена тканевая матрица, с которой приготовлены гистологические срезы толщиной 4 мкм. Тканевая матрица окрашена иммуногистохимическим методом, согласно протоколу производителя: стрептавидин-биотиновым методом с первичными антителами к Ki-67 (клон MIB-1, DAKO) и хромогеном – new fuchsin. Перед окрашиванием срезы автоклавировали при 120°С 20 мин в 0,01 М цитратном буфере (рН=6,0). После инкубации с хромогеном срезы отмывали в биди-стиллированной воде. Далее срезы окрашивали азотнокислым серебром по одностадийной методике [9, 15]: во влажной камере при 37°С 19 мин. Докрашивание ядер не проводили, срезы помещали в водную среду Faramount (DAKO). В каждом случае определяли площадь Ag-ЯОР-белков (в мкм2) в ядрах 100 случайно выбранных Ki-67 позитивных клеток с 10–30 цифровых изображений, полученных с соответствующих полей зрения микроскопа при увеличении ×1000 (объектив ×100, 1.25, oil). Компьютерный анализ изображений проводили в программе ImageJ 1.42. Во избежание ошибок в измерениях гранулы размером менее 0,1 мкм2 исключены из анализа.

Статистический анализ данных осуществляли в программе STATISTICA 6.0. Так как полученные данные в выборках соответствовали критериям нормального распределения (критерий Шапиро – Уилка, W=0,98, р>0,05), то меру центральной тенденции в группах представляли в виде среднего (М), а меру рассеяния – в виде стандартного отклонения (SD). При проверке статистических гипотез применяли непараметрические методы: однофакторный тест Краскела – Уоллиса, U-тест Манна – Уитни, коэффициент корреляции рангов Спирмена. Определяли общую скорректированную выживаемость больных за пятилетний период после операции, использовали метод Каплана – Мейера, логарифмический ранговый тест, регрессионную модель Кокса. Достоверность полученных критериев оценивали при р<0,05.

Рис. 1. Микрофото. Аргирофильные белки, ассоциированные с ядрышкообразующими районами (Ag-ЯОР-белки) в Ki-67 позитивных и негативных клетках плоскоклеточного рака легкого: с высокой (а) и низкой (б) дифференцировкой, в умеренно дифференцированном плоскоклеточном раке с отсутствием (в) и наличием (г) метастазов в регионарные лимфатические узлы.

Двойная окраска: на антиген Ki-67 – методом иммуногистохимии и на Ag-ЯОР-белки – азотнокислым серебром, ×1000

Результаты исследования

Результат иммуногистохимического окрашивания срезов с первичными антителами к антигену Ki-67 и последующей окраской азотнокислым серебром получали в виде округлых гранул черного цвета (Ag-ЯОР-белки), расположенных на фоне красного ядра (в Ki-67 позитивных клетках), или на фоне коричневого ядрышка, или бледно-желтого ядра (в Ki-67 негативных клетках) (рис. 1). Результаты определения Ag-ЯОР-белков в Ki-67 позитивных клетках плоскоклеточного рака легкого во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами опухоли, а также результаты сравнения между этими группами представлены в таблице.

В плоскоклеточном раке легкого (ПКР) площадь Ag-ЯОР-белков в Ki-67 позитивных клетках составила 10,67 ± 2,78 мкм2. Отмечалось последовательное увеличение площади Ag-ЯОР-белков в Ki-67 позитивных клетках при опухолях стадий Т1, Т2 и Т3, однако статистически значимое отличие найдено для Т3 по сравнению с Т1 и Т2. При размере первичной опухоли менее 3 см площадь Ag-ЯОР-белков в Ki-67 позитивных клетках была меньше, чем в опухоли более 3 см. Найдено статистически значимое увеличение площади Ag-ЯОР-белков в Ki-67 позитивных клетках в плоскоклеточном раке легкого с наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах по сравнению с опухолью без метастазов (рис. 1 в, г). Площадь Ag-ЯОР-белков в Ki-67 позитивных клетках последовательно возрастает при I, II и III стадиях заболевания, однако значимые отличия найдены между III и I–II стадиями; между I и II стадиями – на уровне тенденции статистической значимости. Также последовательное увеличение площади Ag-ЯОР-белков в Ki-67 позитивных клетках прослеживается при снижении дифференцировки опухоли, статистически значимое отличие найдено при высокодифференцированной карциноме по сравнению с умеренно- и низкодифференцированной (рис. 1 а, б). В плоскоклеточном раке легкого площадь Ag-ЯОР-белков в Ki-67 позитивных клетках имела умеренную корреляцию с показателем Т (r=0,33, р<0,001), наибольшим размером опухоли (r=0,35, р<0,001), показателем N (r=0,34, р<0,001), стадией заболевания (r=0,34, р<0,001) и дифференцировкой (r=0,25, р<0,01).

При анализе полученных данных установлено, что на отдаленные результаты лечения ПКР оказывает влияние площади Ag-ЯОР-белков в

Рис. 2. График выживаемости по Каплану – Мейеру больных плоскоклеточным раком легкого с большой (прерывистая линия) и небольшой (сплошная линия) площадью Ag-ЯОР-белков в Ki-67 позитивных клетках. По оси абсцисс – время жизни (в днях), по оси ординат – доля выживших больных

Ki-67 позитивных клетках. В проведенном исследовании общая 5-летняя скорректированная выживаемость больных плоскоклеточным раком легкого составила 46,9 ± 5,2 %. Случаи с площадью Ag-ЯОР-белков в Ki-67 позитивных клетках 10,67 мкм2 и более рассматривались как процессы с большой площадью (57 случаев – 50 %), до 10,67 мкм2 – с небольшой площадью (56 случаев – 50 %). При небольшой площади Ag-ЯОР-белков в Ki-67 позитивных клетках показатели выживаемости больных ПКР плоскоклеточным раком легкого равнялись 72,3 ± 6,7 %, что значимо выше (р<0,001) по сравнению с группой больных с большой площадью Ag-ЯОР-белков в Ki-67 позитивных клетках – 19,6 ± 6,2 % (рис. 2). При однофакторном регрессионном анализе площадь Ag-ЯОР-белков в Ki-67 позитивных клетках плоскоклеточного рака легкого имела влияние на выживаемость больных (χ2=37,7, β=1,79, стандартная ошибка – 0,32, р<0,001). При проведении многофакторного регрессионного анализа (χ2=60,3) влияние на выживаемость больных имели площадь Ag-ЯОР-белков в Ki-67 позитивных клетках (β=1,37, стандартная ошибка – 0,35, р<0,001) и показатель N (β=1,47, стандартная ошибка – 0,50, р=0,003).

Обсуждение

В нашем исследовании найдена взаимосвязь площади Ag-ЯОР-белков в Ki-67 позитивных клетках с клинико-морфологическими параметрами плоскоклеточного рака легкого, однако значимые отличия выявлены при стадиях Т1 и Т2, наибольшем размере опухоли до 3 см, N0 и высокой дифференцировке опухоли. В литературе также показана взаимосвязь отдельных клинико-морфологических параметров плоскоклеточного рака легкого с Ag-ЯОР-белками в Ki-67 позитивных клетках. В част- ности, S. Yamaguchi et al. при немелкоклеточном раке легкого выявили увеличение количества Ag-ЯОР-белков в Ki-67 позитивных клетках при Т4 по сравнению с Т1–3, и при N2–3 по сравнению с N0–1 [16]. У больных раком молочной железы обнаружено увеличение количества Ag-ЯОР-белков в Ki-67 позитивных клетках при опухолях размером более 2 см [7]. Аналогичные данные были получены при раке мочевого пузыря, при котором наблюдалось последовательное увеличение количества Ag-ЯОР-белков в Ki-67 позитивных клетках в группах Т1, Т2,Т3, но значимые различия – только при Т1 [14]. Однако эти результаты были получены при субъективном морфологическом анализе (визуальный подсчет количества Ag-ЯОР-белков), тогда как в нашем исследовании применялась методика объективного анализе (компьютерная программная оценка изображений).

Нами также выявлено, что показатели отдаленной (5-летней) выживаемости выше у больных плоскоклеточным раком легкого с небольшой площадью Ag-ЯОР-белков. Одно- и многофакторный регрессионный анализ показал, что площадь Ag-ЯОР-белков в Ki-67 позитивных клетках имела независимое влияние на выживаемость больных плоскоклеточным раком легкого. В литературе аналогичные результаты были представлены при немелкоклеточном раке легкого [5], раке молочной железы [4, 7, 8] и мочевого пузыря [14]. Исследования, посвященные изучению ядрышковых организаторов в злокачественных опухолях, показывают, что содержание Ag-ЯОР-белков является независимым фактором прогноза течения заболевания [10]. Прогностическая значимость содержания Ag-ЯОР-белков в Ki-67 позитивных клетках связана с разными темпами пролиферации плоскоклеточного рака легкого: при большой площади Ag-ЯОР-белков в Ki-67 позитивных клетках – короткий клеточный цикл пролиферирующих клеток и высокая скорость пролиферации и, наоборот, при небольшой площади – длинный клеточный цикл пролиферирующих клеток и низкая скорость пролиферации.

Ранее нами было проведено исследование площади Ag-ЯОР-белков и индекса метки Ki-67 в плоскоклеточном раке легкого [2]. При плоскоклеточном раке легкого площадь Ag-ЯОР-белков в Ki-67 позитивных клетках имела выраженную корреляцию с площадью Ag-ЯОР-белков (r=0,74, р<0,001), а с индексом метки Ki-67 – на уровне тенденции статистической значимости (r=0,17, р=0,07). Корреляции площади Ag-ЯОР-белков в Ki-67 позитивных клетках и площади Ag-ЯОР-белков с клинико-морфологическими параметрами были одинаковыми. Индекс метки Ki-67 не коррелировал с клинико-морфологическими параметрами. Выживаемость больных плоскоклеточным раком легкого была одинаковой при небольших и больших значениях площади Ag-ЯОР-белков в Ki-67

позитивных клетках и площади Ag-ЯОР-белков. При этом этот показатель был больше при небольшой площади Ag-ЯОР-белков в Ki-67 позитивных клетках – 72,3 ± 6,7 %, по сравнению с небольшим индексом метки Ki-67 – 57,7 ± 7,9 %. Уровень выживаемости при большой площади Ag-ЯОР-белков в Ki-67 позитивных клетках значимо снизался до 19,6 ± 6,2 % по сравнению с большим индексом метки Ki-67 – 38,4 ± 6,4 %.

Таким образом, отсутствуют отличия между результатами определения площади Ag-ЯОР- белков в Ki-67 позитивных клетках и площади Ag-ЯОР-белков при сопоставлении с клиникоморфологическими параметрами и выживаемостью больных плоскоклеточным раком легкого, однако определение площади Ag-ЯОР-белков в Ki-67 позитивных клетках имеет преимущество по сравнению с индексом метки Ki-67. Площадь Ag-ЯОР-белков в Ki-67 позитивных клетках взаимосвязана с клинико-морфологическими параметрами по системе TNM и показателями выживаемости при плоскоклеточном раке легкого.