Эффективность бацикола на основе нового штамма Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis № 25 против вредителей-фитофагов и фитопатогенов

Основная цель биологизации защиты растений состоит в стабильном получении полноценной и экологически безопасной сельскохозяйственной продукции, обеспечивающей восполнение ресурсов биосферы (1). Для производства биологических препаратов, патогенных для насекомых — вредителей сельскохозяйственных культур, используют микроорганизмы различного происхождения. В настоящее время интенсивно разрабатывается направление по применению бактерий, выполняющих фитозащитные функции. Так, патогенными свойствами в отношении вредных насекомых-фитофагов и фитопатогенов обладают бактерии из рода Bacillus (2-14). Среди микробиологических средств защиты растений лидерство принадлежит биопрепаратам, созданным на основе Bacillus thuringiensis Berliner (Вt) (1). В отличие от ядохимикатов эти препараты обладают селективным,

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (Соглашение ¹ 14.604.21.0024, RFMEFI60414X0024).

специфически избирательным действием только на насекомых-вредителей. Особенно важно, что они безвредны для человека, теплокровных животных, полезных насекомых и окружающей среды (15-17).

Отметим, что спорообразующие бактерии Вt — наиболее распространенные агенты микробиологического контроля численности насекомых. Препараты на их основе содержат следующие действующие вещества: споры, кристаллический эндотоксин белковой природы, метаболиты, в некоторых случаях — термостабильный экзотоксин.

Во Всероссийском НИИ сельскохозяйственной микробиологии (г. Санкт-Петербург—Пушкин) созданы биопрепараты энтомопатогенного действия: битоксибациллин — на основе B. thuringiensis var. thuringiensis (ВtН₁), который используется преимущественно против чешуекрылых (1); бацикол — на основе B. thuringiensis var. darmstadiensis (ВtН₁₀), обладающий специфическим действием на жесткокрылых (18), а также антигрибной активностью по отношению к ряду фитопатогенных грибов (19); бактокулицид — на основе B. thuringiensis var. israelensis (ВtН₁₄), высокоэффективный против комаров, мошек, рисового и шампиньонного комариков (20, 21).

Разработке биопрепаратов предшествовали исследования по поиску, выделению, идентификации бацилл группы thuringiensis . Выделенные штаммы, у которых изучены культурально-морфологические, физиологобиохимические, технологические, энтомоцидные и другие свойства, хранятся в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (ВКСМ, г. Cанкт-Петербург—Пушкин). Они представляют коммерческий интерес и могут быть использованы в качестве продуцентов биопрепаратов для контроля численности вредителей сельскохозяйственных растений.

Один из приоритетных штаммов коллекции — штамм B. thuringien-sis var. darmstadiensis ¹ 25, выделенный из трупов колорадского жука в Ленинградской области и служащий продуцентом микробиологического препарата бацикол. Он депонирован в коллекции ВКСМ под регистрационным номером RCAM01490 (22).

В процессе разработки биопрепаратов необходимо создавать и совершенствовать рецептуры питательных сред для микроорганизмов. Кроме того, для получения качественного препарата требуется оптимизация аэрации, температуры, рН, а также правильные дозы, формы и возраст посевного материала.

Целью настоящего исследования был подбор питательных сред, отработка оптимальных режимов культивирования штамма Bacillus thur-ingiensis var. darmstadiensis ¹ 25, определение его технологичности, энтомо-цидной активности, содержания экзотоксина и антифунгального действия.

Методика . Для культивирования штамма Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis ¹ 25 готовили питательные среды различного состава (pH до стерилизации 7,4-7,6), разливали в колбы Эрленмейера по 40-50 мл, стерилизовали в автоклаве при температуре 125 °С в течение 30 мин. После стерилизации pH составляла 6,8-7,2. Охлажденную до 30-35 °С питательную среду засевали культурой, выращенной на скошенном рыбном агаре (РА), и культивировали в колбах на качалке при 220 об/мин и температуре 29 °С в течение 56-70 ч до полного созревания, образования спор и кристаллического эндотоксина.

Определение числа клеток и энтомоцидной активности, выраженной в ЛК₅₀ для личинок колорадского жука Leptinotarsa deсemlineata Say. природной популяции, а также содержания экзотоксина, выраженного в

ЛК₅₀ для личинок комнатной мухи Musca domestica Linn., осуществляли согласно методике (23).

Антифунгальную активность B. thuringiensis var. darmstadiensis ¹ 25 изучали в чашках Петри с использованием метода агаровых блоков (24). Тест-культурами служили грибы Fusarium oxysporum и Botrytis cinerea. Культуральную жидкость B. thuringiensis var. darmstadiensis ¹ 25 (концентрация 5 %) вносили в расплавленную среду Чапека, охлажденную до 40 °С, и разливали в чашки Петри. На поверхность застывшего агара помещали блоки, вырезанные из 10-суточной культуры испытуемых грибов. Контролем служила среда без добавления препарата. Диаметр колоний гриба измеряли через 5 сут. Ингибирующую активность B. thuringiensis var. darm-stadiensis ¹ 25 рассчитывали по формуле Аббота (25):

Степень ингибирования роста колоний гриба =

Дк - До

Дк

½ 100,

где Дк и До — диаметр колонии гриба соответственно в контроле и опыте, см.

Лабораторные опыты по определению инсектицидной активности препарата в отношении рапсового, капустного, хренового, восточного горчичного, ильмового листоедов (Chrysomelidae) проводили следующим образом. Препарат разводили дистиллированной водой до концентраций 1,0; 0,2 и 0,04 % и обрабатывали им листья рапса, хрена, горчицы, капусты, ильма. После подсушивания черенки листьев закрывали влажным ватным тампоном, помещали в пенициллиновые флаконы с водой и переносили в кристаллизаторы. В каждом варианте опыта на листья сажали по 25 личинок соответствующего вида листоеда, кристаллизаторы закрывали бязевой салфеткой (повторность по вариантам 3-кратная). Инсектицидность оценивали по концентрации препарата, вызывающей гибель 50 % личинок (ЛК50) на 5-е сут опыта.

Полевые опыты проводили в разных областях Российской Федерации против ряда вредителей-фитофагов на различных растениях.

На картофеле против колорадского жука испытания проводили в хозяйствах Ленинградской, Новосибирской областей и Ставропольского края. Посадки картофеля площадью 200 м2, заселенные колорадским жуком, обрабатывали препаратом из расчета 12 л/га и расходом рабочей жидкости 400 л/га. Учеты осуществляли на 25 растениях, отобранных по диагонали участка, до обработки и на 5-10-е сут после нее.

В Ленинградской области на участках площадью 100 м2 обрабатывали землянику сорта Полка в период выдвижения бутонов. Норма применения препарата — 10 л/га. Поврежденность бутонов землянично-малинным долгоносиком учитывали до обработки, а также на 10-е и 20-е сут на 25 растениях. Поражение ягод серой гнилью оценивали на 20-е сут.

В Ленинградской, Новосибирской, Волгоградской областях испытывали эффективность препарата против крестоцветных блошек, капустного листоеда и капустной совки на участках площадью 50 м2 на брюкве, рапсе, горчице, капусте. Норма применения препарата — 10 л/га. Учеты проводили до обработки, на 5-е и 10-е сут после нее. Просматривали по 20 растений и подсчитывали процент заселенных.

Биологичекую эффективность препарата рассчитывали по формуле Аббота (25).

Математическую обработку полученных данных проводили по Б.А. Доспехову (26).

Результаты. Подбор оптимизированных сред с учетом особенно- стей культивируемого организма необходим для его наилучшего роста и биосинтеза продуктов жизнедеятельности. Специфика отдельных компонентов имеет существенное значение для развития культуры и образования энтомотоксичных метаболитов. Исследованиями, проведенными Н.В. Кандыбиным с соавт. (1), было установлено, что наибольшая энто-моцидная активность штамма-продуцента бацикола проявляется при культивировании на средах с соевой мукой, дрожжами кормовыми, крахмалом кукурузным, а также на среде с сахарозой и мелассой.

1. Титры спор и содержание экзотоксина в образцах препарата на основе штамма Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis ¹ 25 в зависимости от источника азотного питания ( M ± m , лабораторный опыт)

Источник азота	Титр спор, ½109/мл культуральной жидкости	Содержание экзотоксина, ЛК 50 , мкл/г корма для Musca domestica
Соевая мука	3,40±0,10	3,20±0,20
Ячменная мука	2,70±0,20	2,87±0,10
Гречневая мука + белково-витаминный
концентрат	1,96±0,20	3,30±0,10
Гороховая мука	4,00±0,10	3,10±0,10
Овсяная мука	3,10±0,20	3,36±0,15
Экстракт соевой муки	1,20±0,20	3,51±0,15
Соевая мука + гречневая мука	2,30±0,10	2,96±0,10
Соевая мука + ячменная мука	2,90±0,10	2,90±0,20

Антагонистическая активность образцов препарата на основе штамма Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis ¹ 25 в отношении Fusarium oxysporum (а) и Botrytis cinerea (б) в зависимости от источника азотного питания: 1 — соевая мука, 2 — ячменная мука, 3 — гречневая мука + белково-витаминный концентрат, 4 — гороховая мука, 5 — овсяная мука, 6 — экстракт соевой муки, 7 — соевая мука + гречневая мука, 8 — соевая мука + ячменная мука (лабораторный опыт).

В наших опытах с B. thuringiensis var. darmsta-diensis ¹ 25 мы испытывали разные источники азотного питания — муку ячменную, гороховую, гречневую, овсяную, соевую (23 %) (табл. 1, рис.). В качестве источника углерода использовали кукурузный крахмал.

Наилучшие показатели были получены на среде с гороховой мукой, заменяющей соевую: титр спор в культуральной жидкости (КЖ) — 4½109/мл, активность для комнатной мухи (содержание экзотоксина) в ЛК50 — 3,1 мкл/г корма, ингибирующая активность в отношении F. oxysporum — 70,0 %, B. cine-rea — 75,0 %.

Достаточно высокие показатели были зарегистрированы на средах, приготовленных с использованием ячменной, овсяной муки и смесей соевой муки с гречневой и ячменной. Титр спор в КЖ находился в пределах 2,3½109-3,1½109/мл, содержание экзотоксина 2,87-3,36 мкл/г корма. Ингибирующая активность в отношении F. oxysporum составляла 39,5-65,0 %, B. cinerea — 42,4-69,2 %.

Дальнейшие исследования по подбору режимов культивирования штамма ВtН10 ¹ 25 проводили с использованием среды с гороховой мукой.

Степень аэрации при культивировании Вt в колбах на качалках за- висит от числа оборотов качалки в минуту и от соотношения объема среды к воздуху в колбе. В наших опытах объем среды в колбах емкостью 750 мл варьировал от 25 до 200 мл. Оптимальное развитие культуры наблюдалось при соотношении объема среды к воздуху 1:30 и 1:15 (25 и 50 мл среды в колбе).

Изменения активной кислотности (рН) среды могут зависеть как от ее состава, так и от физиологических особенностей. Мы установили, что максимальный титр спор (3,2½109-4,02½109/мл) обеспечивала питательная среда с рН 6,65-7,2, что согласуется с данными О.А. Дрегваль (27) и Y. Icgen (28).

При изучении влияния дозы, формы и возраста посевного материала на продуктивность штамма B. thuringiensis var. darmstadiensis ¹ 25 использовали объем питательной среды 50 мл. В качестве посевного материала применяли смыв с 7-суточной споровой культуры, выращенной на скошенном рыбном агаре; споровую культуральную жидкость; смыв культуры разного возраста (3-30 сут) с РА.

Доза посевного материала в пределах 0,1-0,5 мл на 50 мл среды, что соответствовало 0,2-1,0 %, не оказывала существенного влияния на продуктивность штамма. Культуру в возрасте от 3 до 30 сут можно было использовать в качестве посевного материала без технологических потерь. Наши данные совпадают с результатами исследований Н.М. Барбашовой и М.Г. Чеверды для B. thuringiensis var. thuringiensis (29).

На основе штамма B. thuringiensis var. darmstadiensis ¹ 25 были созданы опытные образцы препарата, проверенные в лабораторных экспериментах. Результаты, представленные в таблице 2, свидетельствуют об эн-томоцидной активности штамма B. thuringiensis var. darmstadiensis ¹ 25 против личинок листоедов. При этом активность штамма B. thuringiensis var. darmstadiensis ¹ 25 в 1,3-1,4 раза превосходила активность штамма-прототипа B. thuringiensis var. darmstadiensis ¹ 109.

2. Инсектицидная активность штаммов Bacillus thuringiensis var. darmstadien-sis ¹ 25 в отношении разных видов листоеда ( M ± m , лабораторный опыт)

Штамм-продуцент	ЛК50 (%) для личинок листоедов на 5-е сут после обработки
	восточный горчичный листоед ( Co-laphellus hofti Men.)	рапсовый цветоед ( Meligethes aene-us F.)	капустный листоед ( Phaedon coch-leariae F.)	ильмовый листоед ( Хanthogaleruca luteola Midler.)

BtH 10 ¹ 25       0,062±0,012          0,056±0,010          0,050±0,010            0,070±0,015

BtH 10 ¹ 109      0,086±0,020          0,077±0,015          0,064±0,015            0,090±0,020

Оценка эффективности препарата на основе штамма B. thuringiensis var. darmstadiensis ¹ 25, проведенная в полевых условиях против вредителей-фитофагов, показала его высокую инсектицидную активность (табл. 3).

3. Эффективность жидкого бацикола на основе штамма Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis ¹ 25 против вредителей-фитофагов (разные регионы Российской Федерации, 2000-2012 годы)

Вид насекомого-вредителя	Культура	Биологическая эффективность, %
Колорадский жук ( Leptinotarsa decemlineata Say.)	Картофель	96-100
Крестоцветные блошки комплекса видов из рода Phyllotreta	Капуста	94-98
Восточный горчичный листоед ( Colaphellus hofti Men.)	Горчица	98
Хлебная полосатая блошка ( Phyllotreta vittula Redt.)	Яровые зерновые	92
Злаковая пьявица ( Oulema melanopus L.)	Зерновые	82-100
Рапсовый цветоед ( Meligethes aeneus F.)	Рапс	79-86
Капустный листоед ( Phaedon cochleariae F.)	Капуста	84-99
Ильмовый листоед ( Хanthogaleruca luteola Midler.)	Капуста	89-93
Трипсы ( Thysanoptera )	Цветочные культуры	80-90

П р и м еч ани е. Районы проведения опытов см. в разделе «Методика».

Ранее в опытах in vitro мы установили антифунгальное действие препарата на основе B. thuringiensis var. darmstadiensis в отношении патогенных грибов Botrytis cinerea , разных видов рода Fusarium , Rhizoctonia , Bipolaris sorokiniana , Alternaria sp. и др. Антифунгальная активность также подтверждена полевыми испытаниями (19).

В настоящей работе в полевых экспериментах была показана по-лифункциональная активность препарата на основе штамма B. thuringiensis var. darmstadiensis ¹ 25 против землянично-малинного долгоносика An-thonomus rubi и серой гнили Botrytis cinerea (табл. 4).

• 4.    Эффективность препарата (доля пораженных растений) на основе Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis ¹ 25 против Anthonomus rubi и Botrytis cinerea на землянике сорта Полка (Лениградская обл., 2013 год)

	Землянично-малинный долгоносик				Серая гниль
Вариант	10-е	биологическая	20-е	биологическая	20-е	биологическая
	сут	эффективность, %	сут	эффективность, %	сут	эффективность, %

BtH 10 ¹ 25          4,8         79,3-81,0        7,9         66,5-69,3         4,0         85,2-89,2

Контроль

(без обработки) 17,1                         25,1                          37,1

Таким образом, проведенные лабораторные и полевые опыты подтвердили высокую эффективность (79-100 %) препарата бацикол на основе нового штамма Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis ¹ 25 против жесткокрылых фитофагов и фитопатогенов на различных сельскохозяйственных культурах, а также его высокую антифунгальную активность. Для штамма B. thuringiensis var . darmstadiensis ¹ 25 разработаны оптимальные режимы культивирования, его технологичность на среде с гороховой мукой составляет 4½10⁹ спор/мл культуральной жидкости. Следует отметить, что в условиях дефицита биопрепаратов наиболее перспективно направление разработки микробиологических препаратов с поли-функциональными свойствами.

Л И Т Е Р А Т У Р А

Sel’skokhozyaistvennaya biologiya [ Agricultural Biology ], 2015, V. 50, ¹ 3, pp. 361-368

EFFICIENCY OF BATSIKOL BASED ON A NEW STRAIN Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis ¹ 25 FOR BIOCONTROL OF PHYTOPHAGOUS PESTS AND PHYTOPATHOGENS

Научные собрания

НАУЧНАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ И ШКОЛА МОЛОДЫХ УЧЕНЫХ «ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ ПРОБЛЕМЫ СОВРЕМЕННОЙ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ» , посвященная 125-летию Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН

(23-27 ноября 2015 года, г. Москва, ИФР РАН)

Организаторы: Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Общество физиологов растений России, Научный совет по физиологии растений и фотосинтезу РАН

Тематика:

• ◼    Регуляция экспрессии генома и трансдукция сигналов в процессах клеточной дифференцировки и онтогенеза растений

• ◼    Физиология, биохимия и экология фотосинтеза, дыхания и фиксации азота как теоретическая основа продукционного процесса

• ◼    Молекулярные и физиологические основы адаптации растений в связи с экологическими стрессами и глобальными биосферными явлениями

• ◼    Биология фототрофных и гетеротрофных клеток растений как основа развития инновационных биотехнологий

Контакты и информация: ,