Эффективность локального трансгенеза клеток яйцевода кур под воздействием гормональной стимуляции

Создание трансгенных кур-биореакторов - перспективное направление биотехнологии. Однако, несмотря на заметные успехи в области трансгенеза птиц, эта задача представляет сегодня определенную проблему, что требует поиска и разработки альтернативных методов направленного переноса генов, один из которых - генетическая трансформация отдельных органов, в частности яйцевода кур (соматический трансгенез). Этот метод позволяет значительно сократить затраты средств и времени на получение трансгенных организмов по сравнению с использованием для адресной доставки ДНК других клеток-мишеней (клеток бластодермы, примордиальных зародышевых клеток, эмбриональных стволовых клеток), проведение генно-инженерных манипуляций с которыми возможно только на эмбриональном материале. Целью настоящей работы было изучение эффективности доставки рекомбинантной ДНК в клетки яйцевода кур in vivo и разработка методических подходов, позволяющих при этом повысить результативность трансгенеза. В работе использовали ретровирусный вектор pLN-GFP, полученный на основе вируса лейкемии мышей Молони (Mo-MuLV), в состав которого была клонирована последовательность маркерного гена GFP (зеленый флюоресцирующий белок). Для упаковки ретровирусного вектора pLN-GFP применяли пакующую клеточную линию GP+envAM12. Оптимальный срок введения генных конструкций определяли на основании анализа пролиферативной активности клеток яйцевода кур кросса Птичное в возрасте 1; 2; 3; 4; 4,5 и 5 мес, а также в возрасте 2 мес через 24 и 48 ч после гормональной стимуляции 0,1 % раствором синэстрола. Введение ретровирусного вектора осуществляли посредством инъекции раствора генной конструкции непосредственно в белковую часть яйцевода кур в возрасте 4 мес без предварительной гормональной стимуляции (I группа) и в возрасте 2 мес через 24 ч после введения синэстрола (II группа). Анализ интеграции и экспрессии рекомбинантной ДНК в клетках яйцевода кур осуществляли в возрасте 6 мес. При гистологическом исследовании максимальную пролиферативную активность клеток белковой части яйцевода наблюдали в период от 4 до 4,5 мес: относительное содержание ДНК в клетках повысилось на 3,4 отн. ед., что было равнозначно увеличению этого показателя за весь предыдущий период с 1-го по 4-й мес. У 2-месячных кур через 24 ч после инъекции синэстрола выявлено значительное изменение структуры яйцеводов, характерное для белковой части этого органа у кур в возрасте 4 мес. Через 48 ч гистоструктура яйцевода соответствовала таковой у половозрелой курицы. Средняя эффективность генетической трансформации клеток яйцевода кур, оцененная по отношению числа трансформированных клеток яйцевода к общему числу исследованных клеток этого типа, составила 17,2±3,1 % в I группе и 57,3±6,3 % во II группе. Таким образом, использование гормональной обработки позволило в 3,3 раза повысить результативность локального трансгенеза клеток яйцевода кур.