Эффективность ПЦР-маркера F311 гена SGR при оценке устойчивости линий огурца к ложной мучнистой росе (Pseudoperonospora cubensis)
Автор: Теплякова Д.Д.
Журнал: Овощи России @vegetables
Рубрика: Селекция, семеноводство и биотехнология растений
Статья в выпуске: 6 (74), 2023 года.
Бесплатный доступ
Актуальность. Ложная мучнистая роса (ЛМР), вызываемая Pseudoperonospora cubensis, является серьезной проблемой при выращивании огурца как в открытом, так и в защищенном грунте. Одним из самых эффективных методов борьбы с ЛМР является выращивание генетически устойчивых гибридов. Для создания, которых в селекционную работу необходимо включать генетические маркеры, ускоряющие и увеличивающие точность отбора. Генетический маркер F311 гена SGR обеспечивает устойчивость к разрушению хлорофилла, что позволяет значительно снизить темпы развития ложной мучнистой росы, а также сохранить рост и развитие растений. Материал и методы. В 2021-2022 годах в Крымском селекционном центре в весеннем обороте в открытом грунте изучили родительские линии огурцов. Всего было изучено 39 образцов. Оценили их устойчивость к ложной мучнистой росе на естественном инфекционном фоне по 5-ти бальной шкале. В качестве стандартов были выбраны гибриды: St устойчивости Феникс+, St восприимчивости -Fi Чайковский, набравший максимальный балл поражения при визуальной оценке, Весь изучаемый материал проверили на наличие гена устойчивости к разрушению хлорофилла SGR при помощи ПЦР-анализа с использованием маркера F311.
Естественный инфекционный фон, pseudoperonospora cubensis, генетические маркеры, устойчивость к разрушению хлорофилла, родительские линии, огурец
Короткий адрес: https://sciup.org/140303339
IDR: 140303339 | DOI: 10.18619/2072-9146-2023-6-11-16
Текст научной статьи Эффективность ПЦР-маркера F311 гена SGR при оценке устойчивости линий огурца к ложной мучнистой росе (Pseudoperonospora cubensis)
Оригинальная статья / Original article УДК 635.63:631.547.52:577.2
Одним из самых распространенных и вредоносных заболеваний огурца является ложная мучни- стая роса (пероноспороз). Возбудитель – оомицет Pseudoperonospora cubensis Rostowz.
Ежегодно эпифитотия ложной мучнистой росы угрожает производству огурца в более чем 80 странах мира [1].
При высоком инфекционном фоне, потери урожая могут составлять от 30 до 70 %, в зависимости от условий года, выращиваемых сортов и гибридов, от сроков появления болезни относительно стадии развития растений и т.д.
Заболевание визуально проявляется в виде желто- зеленых угловатых сухих пятен, распространяющихся по всей поверхности листа. Хлорофилл разрушается и листья приобретают бронзоватый буро-коричневый цвет, высыхают и рассыпаются [1,2,3].
Для интенсивного развития заболевания, в период спороношения пероноспоровых грибов требуется высокая влажность воздуха. Рассеиванию зооспор больше благоприятствует сухая погода, а для их прорастания и заражения необходима влага. Для развития пероноспороза достаточно наличие росы, которая выпадает ночью и ранним утром. Поэтому возбудитель может поражать огурец в районах и с засушливым климатом [2,4,5].
Большое влияние оказывает температурный режим, обильное образование зооспор и наиболее короткий инкубационный период наблюдаются при сочетании среднесуточной температуры 18-26oС и наличия росы на листьях в течение 3-4 ч. Температура выше 300С ограничивает развитие болезни. Наиболее благоприятные условия для развития заболевания – большой перепад температуры с низкими температурами в ночной период и с высокими – в дневной [1,3,5,6].
Самым распространенным способом борьбы с заболеванием является использование фунгицидов. А самым перспективным, эффективным, экономически выгодным и экологичным является использование устойчивых сортов и гибридов [7].
Значительная работа, направленная на изучение, поиск и создание устойчивых к пероноспорозу сортов и гибридов, проводится в разных странах.
Учеными ВИР и его филиалов проведен многолет-нийскрининг коллекции огурца по устойчивости к лож-
Рис.1. а – образец без устойчивости к разрушению хлорофилла; б – образец с устойчивостью к разрушению хлорофилла
Fig.1. a – sample withoutresistance to chlorophylldestruction;
b – sample with resistance to chlorophyll destruction
ноймучнистой росе. На базе Крымской и Майкопской опытных станций – в период с 1985 по 2005 годы проанализировано свыше 4200 образцов огурца из мировой коллекции ВИР, включая новые сорта и гибриды отечественной и зарубежной селекции. В результате этих исследований установлено, что число устойчивых и относительно устойчивых образцов составляет от 1,2% до 5,0% от общего, и сделан вывод об отсутствии образцовс полной устойчивостью к ложной мучнистой росе. В популяции огурца нет генотипов с полной вертикальной устойчивостью [7].
Осложняет задачи селекции необходимость сосредоточить в одном генотипе устойчивость к ЛМР, которая имеет рецессивный характер наследования (контролируется тремя генами dm (downy mildew), dm1.1, dm5.1, dm5.3, расположенных в разных хромосомах) и требуемый комплекс хозяйственно ценных признаков [5,6].
Также активно ведется селекционная работа с геном SGR ( stay green resistance ), который кодирует белок senescence-inducible chloroplast stay-green protein, участвующий в процессе разрушения хлорофилла в хлоропластах [8].
Изначально ген SGR обеспечивает желтую окраску листьев, разрушая зеленый пигмент хлорофилл, в результате чего становятся видимыми желтые пигменты каротиноиды. А мутации, выводящие ген из строя (так же, как и выключение этого гена методом РНК-интерференции) приводят к тому, что при старении листьев или созревании семян хлорофилл не разрушается и они сохраняют зеленую окраску. Ген широко известен и используется не только в культуре огурца, но и у других культу, например, фасоли, кукурузы, риса, садового гороха, арабидопсиса и т.д [9,10].
Устойчивость к разрушению хлорофилла позволяет значительно снизить темпы развития ложной мучнистой росы, обеспечивает рост и развитие растений, а также сохраняет и продлевает период плодоношения [8,11,12].
Использование генетического маркера F311, позволяющего определить наличие мутации SGR в генотипе, позволяет значительно ускорить селекционный процесс отбора устойчивых и более продуктивных образцов (рис. 1).
Материалы и методы
В 2021-2022 годах на базе Крымского селекционного центра в весеннем обороте в открытом грунте был заложен опыт по изучению и оценке устойчивости к ложной мучнистой росе родительских линий огурца на естественном инфекционном фоне и определению эффективности работы маркера F311.
Устойчивость к ложной мучнистой росе оценивали по методикам, предложенным отделом иммунитета ВИР для овощных культур, используя шкалу устойчивости в баллах, где:
-
0 – поражение отсутствует – иммунность;
-
0,1 балл – единичные признаки болезни; – устойчивость;
-
1 балл – среднее поражение (поражено около 25%поверхности листьев) – относительная устойчивость;
-
2 балла – сильное поражение (поражено до 50% поверхности листьев) – восприимчивость;
-
3 балла – очень сильное поражение, вызывающее гибель растений – сильная восприимчивость [11,13]. Оценку устойчивости проводили индивидуально по каждому растению и затем вычисляли среднее по образцу. Всего было изучено 39 образцов, из них 37 родительских линий и 2 стандарта: St устойчивости Феникс + не поразившийся ЛМР, по результатам ПЦР анализа устойчивый к разрушению хлорофилла и сохранивший зеленую окраску листьев до конца вегетации, и St восприимчивости F1Чайковский – восприимчивый, почти 50% поверхности листьев были поражены ЛМР, было отмечено так же пожелтение листьев. Гибрид голландской компании Райк Цваан (Rijk Zwaan).
Для расчета эффективности работы маркера F311 сопоставили и рассчитали отношение результатов ПЦР-анализа, показавшего количество образцов с наличием мутации SGR в генотипе, и результаты визуальной оценки устойчивости образцов к разрушению хлорофилла.
А для определения эффективности применения маркера F311 для оценки устойчивости к ЛМР рассчитали отношение результатов ПЦР-анализа и результаты визуальной оценки поражения ЛМР на естественном фоне.
Результаты и их обсуждение
Из изученных тридцати девяти образцов у двадцати одного, включая стандарт St Феникс+, по результатам ПЦР-анализа есть устойчивость к разрушению хлорофилла (номера с 1 по 20 и 39 (табл. 1). У восемнадцати образцов со стандартом St F 1 Чайковский такая устойчивость отсутствует.
При визуальной оценке у двадцати четырех образцов в течении вегетационного периода оставалась зеленой окраска листьев, из них у двадцати образцов результат ПЦР-анализа показал наличие устойчивости (аллель R ).
Сохранение хлорофилла способствовало сдерживанию развития ложной мучнистой россы. В данной группе максимальный балл поражения ЛМР составил 2,3 балла у образца 8157-20 (№20), листья сохраняли зеленую окраску, но очаги поражения достаточно быстро развивались в виде сухих коричневых хлоротичных пятен, и также не было роста и развития основного стебля и боковых побегов, что привело к достаточно быстрому высыханию и гибели растений.
У четырех образцов с листьями, сохранившими зеленую окраску, по результатам ПЦР-анализа отсутствует ген устойчивости к разрушению хлорофилла – идентифицирован аллель S (№№ 35-38) из них у двух образцов 9474-20 и 6914-20 индекс развития болезни равен 0,8 баллам, признаки поражения были слабыми или отсутствовали. Предположительно, у данных образцов устойчивость к ЛМР контролируется сочетанием нескольких основных рецессивных генов dm. Таким образом, генетический фон гена SGR с аллелем S является хорошим «проявителем» наличия нескольких генов dm вместе. К данным образцам уделено особое внимание, так как если в последующих испытаниях предположение подтвердится, то данные линии будут ценным источником генетической устойчивости к ЛМР в селекционном процессе.
Таблица 1. Устойчивость родительских линий к ЛМР и эффективность работы маркера F311 (Селекционный центр г. Крымск, 2021–2022 годы)
Table 1. Resistance of parental lines to Pseudoperonospora cubensis and the effectiveness of the F311 marker. (Selection center Krymsk, 2021–2022)
|
№ |
Названия |
Окраска листьев |
ПЦР-анализ SGR |
Визуальная оценка ЛМР, балл |
Урожайность, кг/м2 |
||||
|
2021 год |
2022 год |
средний |
2021 год |
2022 год |
средняя |
||||
|
1 |
St Феникс + |
зеленый |
R |
0,0 |
0,0 |
0,0 |
4,5 |
6,6 |
5,5 |
|
2 |
11612-20 |
зеленый |
R |
0,0 |
0,5 |
0,3 |
5,8 |
7,6 |
6,7 |
|
3 |
2773-20 |
зеленый |
R |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
6,0 |
8,1 |
7,1 |
|
4 |
2124-20 |
зеленый |
R |
1,о |
0,5 |
0,8 |
4,9 |
7,8 |
6,4 |
|
5 |
2095-19 |
зеленый |
R |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
5,7 |
7,9 |
6,8 |
|
6 |
2096-20 |
зеленый |
R |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
5,3 |
7,8 |
6,6 |
|
7 |
11597-20 |
т-зеленый |
R |
1,0 |
1,5 |
1,3 |
6,3 |
7,9 |
7,1 |
|
8 |
2781-19 |
зеленый |
R |
1,5 |
1,0 |
1,3 |
5,9 |
7,6 |
6,8 |
|
9 |
5614-19 |
зеленый |
R |
1,5 |
1,0 |
1,3 |
5,2 |
7,7 |
6,5 |
|
10 |
2067-20 |
зеленый |
R |
1,5 |
1,0 |
1,3 |
5,1 |
7,8 |
6,5 |
|
11 |
2097-19 |
зеленый |
R |
1,0 |
1,5 |
1,3 |
5,1 |
6,9 |
6,0 |
|
12 |
2759-20 |
зеленый |
R |
1,5 |
1,5 |
1,5 |
5,1 |
7,1 |
6,1 |
|
13 |
8159-18 |
зеленый |
R |
2,0 |
1,0 |
1,5 |
3,8 |
6,9 |
5,4 |
|
14 |
2768-20 |
зеленый |
R |
2,0 |
1,5 |
1,8 |
4,0 |
7,1 |
5,6 |
|
15 |
5651-19 |
зеленый |
R |
2,0 |
1,5 |
1,8 |
3,5 |
7,4 |
5,5 |
|
16 |
1940-18 |
зеленый |
R |
2,0 |
1,5 |
1,8 |
3,8 |
8,0 |
5,9 |
|
17 |
7016-20 |
зеленый |
R |
2,0 |
1,5 |
1,8 |
4,3 |
7,1 |
5,7 |
|
18 |
9471-20 |
зеленый |
R |
1,5 |
2,0 |
1,8 |
3,3 |
7,1 |
5,2 |
|
19 |
8158-19 |
зеленый |
R |
2,0 |
1,5 |
1,8 |
3,9 |
5,5 |
4,7 |
|
20 |
8157-20 |
зеленый |
R |
2,5 |
2,0 |
2,3 |
3,5 |
6,5 |
5,0 |
|
21 |
St Fi Чайковский |
желтый |
S |
3,0 |
2,5 |
2,8 |
4,1 |
5,8 |
5,0 |
|
22 |
1264-17 |
желтый |
S |
1,5 |
2,0 |
1,8 |
4,3 |
5,9 |
5,1 |
|
23 |
9485-19 |
желтый |
S |
2,0 |
1,5 |
1,8 |
4,9 |
5,1 |
5,0 |
|
24 |
9478-18 |
желтый |
S |
2,0 |
2,0 |
2,0 |
4,9 |
5,4 |
5,2 |
|
25 |
2139-20 |
желтый |
S |
2,0 |
2,5 |
2,3 |
3,8 |
4,4 |
4,1 |
|
26 |
6864-20 |
желтый |
S |
2,5 |
2,0 |
2,3 |
3,3 |
5,4 |
4,4 |
|
27 |
4407-20 |
желтый |
S |
3,0 |
2,0 |
2,5 |
3,1 |
5,1 |
4,1 |
|
28 |
2092-19 |
желтый |
S |
3,0 |
2,0 |
2,5 |
2,3 |
4,2 |
3,3 |
|
29 |
1339-17 |
желтый |
S |
3,0 |
2,0 |
2,5 |
2,1 |
4,8 |
3,5 |
|
30 |
1242-17 |
желтый |
S |
2,5 |
3,0 |
2,8 |
3,9 |
4,6 |
4,3 |
|
31 |
2077-20 |
желтый |
S |
3,5 |
2,0 |
2,8 |
1,4 |
3,1 |
2,3 |
|
32 |
7000-20 |
желтый |
S |
3,0 |
3,0 |
3,0 |
2,9 |
4,9 |
3,9 |
|
33 |
5709-17 |
желтый |
S |
3,5 |
2,5 |
3,0 |
1,1 |
2,1 |
1,6 |
|
34 |
6978-20 |
желтый |
S |
3,0 |
3,5 |
3,3 |
2,6 |
2,8 |
2,7 |
|
35 |
9474-20 |
зеленый |
S |
1,0 |
0,5 |
0,8 |
3,2 |
7,8 |
5,5 |
|
36 |
6914-19 |
зеленый |
S |
1,0 |
0,5 |
0,8 |
5,4 |
8,3 |
6,9 |
|
37 |
6960-20 |
зеленый |
S |
2,0 |
1,5 |
1,8 |
4,5 |
7,1 |
5,8 |
|
38 |
1989-20 |
зеленый |
S |
2,0 |
2,0 |
2,0 |
2,4 |
6,8 |
4,6 |
|
39 |
7638-18 |
желтый |
R |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
3.9 |
5.4 |
4.7 |
У пятнадцати образцов листья пожелтели,из них у четырнадцати отсутствует устойчивость к разрушению хлорофилла, а у одного образца (№ 39) развитие поражения ЛМР началось в конце вегетационного периода,и максимально было оценено 1 баллом, но растения развивались слабо и были угнетены, данный образец также включён в даль- нейшие испытания для изучения характера его устойчивости. Возможно, тут имело место обратное сочетание генов:устойчивый SGR-R и все гены восприимчивости Dm ., следовательно, полевая устойчивость огурца к ЛМР, обусловленная геном SGR-R значительно превосходит таковую, на основе нескольких генов dm [14, 15].
Таблица 2. Визуальная оценка окраски листьев и данные ПЦР – анализа маркера F311 Table 2. Visual assessment of leaf color and PCR data – analysis of the F311 marker
|
№ |
Визуальная оценка |
ПЦР-анализ (ген SGR) (количество образцов) |
Всего |
|
|
окраски листьев |
R |
S |
||
|
1 |
Желтый |
1 |
14 |
15 |
|
2 |
Зеленый |
20 |
4 |
24 |
|
Вcего |
22 |
17 |
39 |
|
Из общего числа образцов лишь у пяти не совпали результаты визуальной оценки и результаты ПЦР анализа (табл. 2). Возможно, из-за обратного сочетания с генами dm. Эффективность работы маркера F311 составила: 34/39*100=87 ,2%. Применение в селекционной работе данного маркера позволит значительно ускорить и упростить отбор материала cбольшим потенциалом, более жизнеспособных и стрессоустойчивых образцов.
По результатам визуальной оценки поражения ЛМР все образцы можно разделить на три группы (табл. 3).
ные - сдерживающие развитие ЛМР.
В третей группе, у оставшихся 14 образцов (№№ 20, 21, 24-34 и 38) было отмечено достаточно сильное поражение ЛМР (от 2 и выше баллов) – их выделили как неустойчивые.
Сопоставив данные визуальной оценки поражения ЛМР и ПЦР анализа, определили, что эффективность работы маркера в условиях данного опыта составляет (7+13+13)/39=84,6% , что довольно высоко и подтверждает большую эффективность гена SGR относительно комплекса генов dm .
Эффективность высокая, применение маркера
Таблица 3. Визуальная оценка устойчивости к ЛМР и данные ПЦР – анализа маркера F311
Table 3. Visual assessment of resistance to Pseudoperonospora cubensis and data from PCR analysis of the F311 marker
№
Визуальная оценка поражения ЛМР
Устойчивые
Толерантные
Неустойчивые
Всего
|
ПЦР- анализ (ген SGR) (количество образцов) |
|
|
R |
S |
|
7 |
2 |
|
13 |
3 |
|
1 |
13 |
|
21 |
18 |
Всего
В первой группе у 9 образцов (№№ с 1 по 6 и 35, 36) поражение ЛМР отсутствует или очень слабое от 0 до 1 балла.Из данной группы только у 6 образцов (St Феникс +, 11612-20, 2773-20, 2124-20, 209519 и 2096-20) ПЦР – анализ показал наличие устойчивости к разрушению хлорофилла, их отметили как устойчивые.
Во второй группе (№№ 7-19 и 35-37) у шестнадцати образцов было отмечено поражение от 10 до 25% поверхности листьев (1,3-1,8 баллов), из них у трех (№№ 35-37) отсутствует устойчивость к разрушению хлорофилла по данным ПЦР-анализа,а,по визуальной оценке, только у двух линий пожелтели листья. Тринадцать образцов с сохранившейся окраской листа и наличием гена устойчивости к разрушению хлорофилла отметили как толерант- позволит увеличить скорость отбора устойчивых образцов к ЛМР.
Также на всех делянках был проведен учет уро-жая,за период вегетации было сделано 7 сборов. Более высокий уровень урожайности был у образцов, устойчивых к ЛМР и сохранивших зеленую окраску листьев.Средняя урожайность устойчивых образцов составила 6,03 кг/м2, а у неустойчивых образцов – 3,87 кг/м2, что на 36% ниже (табл. 1).
По результатам исследований можно сделать вывод,что использование маркера гена SGR позволит значительно ускорить процесс отбора и создания устойчивых к ЛМР,более стрессоустойчивых и продуктивных гибридов.
Об авторе:
Aboutthe Author:
Daria D. Teplyakova – Researcher, Laboratory of Pumpkin Crops, ,
Список литературы Эффективность ПЦР-маркера F311 гена SGR при оценке устойчивости линий огурца к ложной мучнистой росе (Pseudoperonospora cubensis)
- Ахатов А.К. Мир огурца глазами фитопатолога. М.: Тов-во науч. Изданий «КМК», 2020. С. 166-171.
- Обручков А.Ю. Новые партенокарпические гибриды огурца, слабовосприимчивые к ложной мучнистой росе. Овощи России. 2018;(5):95-97. https://doi.org/10.18619/2072-9146-2018-5-95-97. EDN YPELZJ.
- Борасулов А.М. Селекционная линия огурца с-25/2 устойчивая к ложной мучнистой росе. Перспективы развития науки и образования в современных экологических условиях: материалы международной научно-практической конференции /сост. Н.А. Щербакова / с. Соленое Займище. ФГБНУ «ПНИИАЗ». Соленое Займище, 2017. С. 405-407.
- Чистякова Л.А., Бирюкова Н.К. Оценка селекционных линий огурца на устойчивость к пероноспорозу и мучнистой росе. Гавриш. 2012;(1):38-41. EDN OOZLMD.
- Налобова В.Л. Ложная мучнистая роса (пероноспороз) тыквенных культур/ Овощеводство. 2022;(25):79-86. https://veget.belal.by/jour/article/view/14
- Литвинов С.С. Методика полевого опыта в овощеводстве. М., 2011. С. 404-405.
- Суханбердина Э.Х., Грушин А.А., Пискунова Т.М. Скрининг коллекции огурца по устойчивости к ложной мучнистой росе в зоне нижнего Поволжья. Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции. 2019;180(2):102-108. https://doi.org/10.30901/2227-8834-2019-2-102-108. EDN NDVAFG.
- Коротцева И.Б. Устойчивость огурца к ложной мучнистой росе в условиях Нечерноземной зоны РФ. Овощи России. 2020;(6):116-119. https://doi.org/10.18619/2072-9146-2020-6-116-119. EDN DZJGVY.
- Davis J., Myers J.R., McClean P., Lee R. Staygreen (SGR), a candidate gene for the persistent color phenotype in common bean. ISHS Acta Horticulturae 859: International Symposium on Molecular Markers in Horticulture. https://doi.org/10.17660/ActaHortic.2010.859.10.
- Xu W., Rosenow D. T., Nguyen H. T. Stay green trait in grain sorghum: relationship between visual rating and leaf chlorophyll concentration. Plant Breeding. 2000;119(4):365-367. https://doi.org/10.1046/j.1439-0523.2000.00506.x
- Lebeda A., Cohen Y. Cucurbit downy mildew (Pseudoperonospora cubensis) – biology, ecology, epidemiology, hostpathogen interaction and control. European Journal of Plant Pathology. 2011;129(2):157-192. https://doi.org/10.1007/s10658-010-9658-1
- Налобова В.Л. Селекция огурца на устойчивость к болезням. Мн.: Белпринт, 2005. 200 с.
- Маслиенко Л.В., Арасланова Н.М., Ковчигина М.А. Поиск оптимального метода искусственного заражения подсолнечника возбудителем ложной мучнистой росы для определения эффективности опытных образцов микробиопрепаратов. Масличные культуры. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. 2014;2(159-160):156-162. – EDN. TJFWSL.
- Kang S.-I., Hwang I., Goswami G., Jung H.-J., Nath U.K., Yoo H.-J., Lee J.M., Nou I.S. Molecular Insights Reveal Psy1, SGR, and SlMYB12 Genes are Associated with Diverse Fruit Color Pigments in Tomato (Solanum lycopersicum L.). Molecules. 2017;22(12):2180. https://doi.org/10.3390/molecules22122180
- Park S.-Y., Yu J.-W., Park J.-S., Li J., Yoo S.-Ch., Lee N.-Y., Lee S.- K., Jeong S.-W., Seo H. S., Koh H.-J., Jeon J.-S., Park Y.-I., Paek N.-Ch. The Senescence-Induced Staygreen Protein Regulates Chlorophyll Degradation. The Plant Cell. 2007;19(5):1649–1664. https://doi.org/10.1105/tpc.106.044891
