Эффективность представителей сем. Bacillaceae против возбудителей плесневения семян рапса

Funding: the work was carried out with the financial support of the Krasnoyarsk Regional State Autonomous Institution "Krasnoyarsk Regional Fund for the Support of Scientific and Scientific-Technical Activities" as part of the scientific research and development under project N 2023030309439 "Development of a biological product for protecting rapeseed from fungal diseases and stimulating the growth of rapeseed in the soil and climatic conditions of the Krasnoyarsk Region".

Введение. Рапс (Brassica napus L.) широко используется в качестве пищевой, кормовой и технической культуры. При переработке семян рапса получают рапсовое масло, используемое как в кулинарии, так и в качестве биодизеля, а также высокобелковый жмых, используемый в качестве корма в животноводстве [1]. За последнее десятилетие мировое производство рапса выросло более чем на 20 %, сделав рапс второй по значимости масляничной культурой, на долю которой приходится более 12 % мирового производства растительного масла [2]. В Российской Федерации темпы роста производства рапса значительно превышают общемировые, а лидером среди субъектов федерации по посевным площадям под данной культурой является Красноярский край [3].

Одним из главных факторов, препятствующих полной реализации биологического потенциала рапса в плане урожайности, являются передающиеся через семена фитопатогенные грибы (главным образом представители родов Fusarium и Alternaria ), а также возбудители плесневения семян р.р. Penicillium, Aspergillus, Cladosporium, Mucor . При этом возбудители плесневения семян, хотя формально и не являются фитопатогенами, поражают семена при хранении, значительно снижая их посевные качества, что позволяет отнести данные грибы к возбудителям болезней растений [4, 5].

Наиболее распространенным способом борьбы с возбудителями болезней рапса и других культур является предпосевное протравливание семян фунгицидами. Однако данный метод экологически небезопасен и ведет к повышению химической нагрузки на окружающую среду. Кроме того, во всем мире наблюдается неуклонный рост резистентности фитопатогенных микроорганизмов к применяемым химическим препаратам [6, 7]. Перспективной альтернативой химическим протравителям являются биопрепараты на основе штаммов-антагонистов возбудителей болезней [8]. При этом, по мнению ряда авторов, предпочтение следует отдавать биопрепаратам, созданным на основе комбинации штаммов-антагонистов [9, 10]. Ранее нами была продемонстрирована возможность использования выделенных из автохтонных почвенных и ризосферных микробных сообществ штаммов сем. Bacillaceae в качестве антагонистов актуальных для Красноярского края возбудителей грибных болезней рапса Fusarium spp., Alternaria spp., Sclerotinia sclerotiorum и предложены комбинации этих штаммов для создания биопрепаратов широкого спектра действия [11].

Цель исследования – оценить антибиотическую активность различных представителей семейства Bacillaceae в отношении возбудителей плесневения семян рапса Fusarium sp., Aspergillus sp., Penicillium sp., Mucor sp.

Объекты и методы. В качестве антагонистов использовали выделенные нами из почвенных и ризосферных сообществ Красноярского края штаммы Bacillus altitudinis RSA2, Bacillus atro-phaeus RSA9, RSA19, СХ6, RSA1 (запатентован авторами под номером B-13893), RSA8, RSA16(1), RSA16(2), RSA18, Bacillus cereus АЛ3, СХ5, Bacillus megaterium RSA4, Bacillus simplex RSA15, Bacillus subtilis RSA17, RSA20(1), RSA20(2), RSA11, Bacillus sp . Ра1, Ра2, Ра3, Ал4, Хч.1 и Peribacillus simplex RSA12. Выбор данных штаммов обусловлен тем, что в предыдущих исследованиях они показали высокую антибиотическую активность против фитопатогенных грибов – возбудителей болезней ярового рапса Sclerotinia sclerotiorum , Alternaria spp . и Fusarium spp . [11, 12].

В качестве тест-культур использовали изоля-ты Fusarium sp ., Aspergillus sp ., Mucor sp . и два различающихся на уровне принадлежности к разным видам изолята Penicillium sp . Указанные изоляты были выделены нами из пораженных плесневыми грибами семян рапса сорта Надежный 92 производства федерального государственного унитарного предприятия «Михайловское» (Красноярский край, Ужурский район), урожай 2023 г. Проверку антибиотической активности изучаемых штаммов в отношении возбудителей плесневения семян выполняли методом двойных (встречных) культур (dual culture assay) по ширине зоны отсутствия роста тест-культуры в присутствии штамма-антагониста [12, 13] (рис. 1). В качестве питательной среды, хорошо поддерживающей рост как изучаемых штаммов, так и мицелиальных грибов, использовали среду № 2 ГРМ (Сабуро) ФБУН ГНЦ ПМБ, разведенную в два раза и дополненную агаром до 20 г/л [12, 14]; время инкубирования составляло 10 сут, температура инкубирования (25 ± 1) °C; повторность трехкратная.

Статистическую обработку результатов проводили двухфакторным дисперсионным анализом, факторами служили тест-культура гриба и штамм бактерий-антагонистов. В качестве post hoc тестов для парного сравнения индивидуальных средних после проведения дисперсионного анализа использовали тесты Шеффе и Тьюки [15]; в качестве программного обеспечения использовали математический пакет StatSoft STATISTICA 8.0.

Рис. 1. Метод встречных культур на примере изолята Mucor sp.:

1 – рост гриба в контроле; 2 – в присутствии штамма-антагониста RSA16(2) Counterculture method using the Mucor sp. isolate as an example:

1 – fungal growth in the control; 2 – in the presence of the antagonist strain RSA16(2)

Результаты и их обсуждение. Из 23 протестированных штаммов 3 не проявили антибиотической активности в отношении тест-культур, остальные 20 ингибировали рост как минимум од- ной тест-культуры; при этом уровень антибиотической активности зависел как от тест-культуры, так и от штамма (табл. 1, рис. 2, 3).

Таблица 1

Зоны подавления роста тест-культур в присутствии изучаемых штаммов (представлены данные, усредненные по трем повторностям),мм Zones of growth inhibition of test cultures within the studied strains (data are presented, averaged over three repetitions), mm

Штамм	Тест-культура
	Aspergillus sp .	Fusarium sp .	Penicillium		Mucor sp .
			изолят 1	изолят 2
RSA1	7,00	7,00	11,33	0,00	10,33
RSA2	10,00	0,00	9,81	21,00	0,00
RSA8	1,33	10,00	14,00	0,00	10,33
RSA9	10,67	4,67	7,00	0,00	9,00
RSA11	9,67	12,00	12,00	0,00	15,33
RSA15	0,00	5,33	10,00	0,00	6,00
RSA16(1)	15,00	12,00	9,33	11,00	13,00
RSA16(2)	13,67	9,33	0,00	0,00	15,67
RSA17	13,00	12,00	13,00	0,00	15,00
RSA18	0,00	9,00	14,00	0,00	4,33
RSA19	12,33	8,33	10,00	0,00	11,33
RSA20(1)	8,00	11,67	11,00	7,00	10,00
RSA20(2)	11,67	10,00	17,33	3,67	13,33
Хч.1	3,00	0,00	4,67	0,00	0,00
CХ5	0,00	11,00	0,00	0,00	0,00
СХ6	13,33	0,00	10,33	3,67	11,33
АЛ3	13,67	4,00	12,00	0,00	10,67
АЛ4	12,67	11,00	12,33	0,00	8,33
Ра3	8,67	0,00	8,33	0,00	0,00

Статистическая значимость влияния факторов «тест-культура», «штамм бактерий», а также эффекта взаимодействия факторов «тест-культура» х «штамм бактерий» составила p < 0,001; соответствующие показатели силы влияния рав- ны 17,99 %; 21,73; и 42,32 %; на долю случайного варьирования пришлось 17,95 %. Таким образом, основной вклад в варьирование зоны отсутствия роста внесли индивидуальные особенности воздействия штаммов на конкретные тест-культуры.

Рис. 2. Зависимость зоны подавления роста тест-культуры (на примере изолята Aspergillus sp.) от штамма-антагониста:

1 – штамм RSA20(1), видна ярко выраженная зона отсутствия роста тест-культуры;

2 – штамм СХ5, зона отсутствия роста тест-культуры не выражена Dependence of the test culture growth inhibition zone

(using an Aspergillus sp. isolate as an example) on the antagonist strain:

1 – strain RSA20(1), a clearly visible zone of test culture growth inhibition is visible;

2 – strain CX5, the zone of test culture growth inhibition is not clearly visible

Рис. 3. Зависимость антибиотической активности штаммов-антагонистов (на примерештамма RSA8) от тест-культуры:

1 – тест-культура Fusarium sp., зона отсутствия роста тест-культуры ярко выражена;

2 – тест-культура Aspergillus sp., зона отсутствия роста тест-культуры выражена слабо Dependence of the antibiotic activity of antagonist strains (using the RSA8 strain as an example) on the test culture:

1 – Fusarium sp. test culture, the zone of no growth of the test culture is clearly expressed;

2 – Aspergillus sp. test culture, the zone of no growth of the test culture is weakly expressed

В среднем по использованным в работе изо-  штаммы RSA16(1) и RSA20(2), минимальный – лятам возбудителей плесневения семян макси-  штаммы Хч.1 и СХ5 (рис. 4).

мальный антифунгальный эффект показали

Рис. 4. Средняя по изолятам возбудителей плесневения семян зона отсутствия роста тест-культур в присутствии штаммов-антагонистов, мм

Average zone of no growth of test cultures in the presence of antagonist strains for isolates of seed mold pathogens, mm

При этом способность подавлять рост всех без исключения тест-культур продемонстрировали только штаммы RSA16(1) ( B. atrophaeus ), RSA20(1) ( B. subtilis ) и RSA20(2) ( B. subtilis ).

Среди тест-культур максимальную чувствительность к набору изученных штаммов проявил Penicillium sp . (изолят 1), минимальную – Penicillium sp . (изолят 2) (рис. 5).

Зона отсутствия роста в среднем по штаммам-антаго мм

Рис. 5. Средняя по штаммам-антагонистам зона отсутствия роста у разных тест-культур, мм Average zone of no growth for antagonist strains in different test cultures, mm

Тесты Шеффе и Тьюки показали, что статистически значимые различия по средней чувствительности к штаммам-антагонистам наблюдают- ся между Penicillium sp. (изолят 2) и всеми остальными тест-культурами, а также между Peni-cillium sp. (изолят 1) и Fusarium sp. (табл. 4, 5).

Таблица 4

Результаты проверки индивидуальных различий между тест-культурами по средней чувствительности к набору изучаемых штаммов тестом Шеффе (числа в ячейках показывают статистическую значимость различий (p) с округлением до третьего знака после запятой)

Results of testing individual differences between test cultures for average sensitivity to a set of studied strains using the Scheffe test (numbers in cells indicate the statistical significance of differences (p) rounded to three decimal places)

Тест-культура	Aspergillus sp .	Fusarium sp .	Penicillium sp .
			изолят 1	изолят 2
Aspergillus sp .		0,247	0,395	0,000
Fusarium sp .	0,247		0,001	0,000
Penicillium sp . (изолят 1)	0,395	0,001		0,000
Penicillium sp . (изолят 2)	0,000	0,000	0,000
Mucor s p .	1,000	0,235	0,411	0,000

Таблица 5

Результаты проверки индивидуальных различий между тест-культурами по средней чувствительности к набору изучаемых штаммов тестом Тьюки (числа в ячейках показывают статистическую значимость различий (p) с округлением до третьего знака после запятой) Results of testing individual differences between test cultures for average sensitivity to a set of studied strains using the Tukey test (numbers in cells indicate the statistical significance of differences (p) rounded to three decimal places)

Тест-культура	Aspergillus sp .	Fusarium sp .	Penicillium sp .
			изолят 1	изолят 2
Aspergillus sp .		0,133	0,254	0,000
Fusarium sp .	0,133		0,000	0,000
Penicillium sp . (изолят 1)	0,254	0,000		0,000
Penicillium sp . (изолят 2)	0,000	0,000	0,000
Mucor sp .	1,000	0,124	0,268	0,000

Полученные результаты можно интерпретировать следующим образом. Изученные штаммы-антагонисты выделяют не одно антибиотическое вещество, а набор подобных веществ. При этом конкретный состав набора зависит от штамма. В то же время чувствительность возбудителей плесневения семян к разным антибиотическим веществам из этого набора определяется видовой принадлежностью возбудителя. Данные результаты хорошо согласуются с результатами аналогичного исследования, проведенного нами на наборе фитопатогенных грибов – возбудителей болезней рапса [10].

Заключение. На основе изучения антибиотической активности 23 штаммов сем. Bacilla- ceae, выделенных из сельскохозяйственных почв Красноярского края, в отношении 4 таксономически различающихся возбудителей плесневения семян рапса установлено, что лишь 3 штамма проявили способность подавлять рост всех без исключения тест-культур. Такую способность продемонстрировали штаммы RSA16(1) (B. atrophaeus), RSA20(1) (B. subtilis) и RSA20(2) (B. subtilis). С учетом средней по тест-культурам антибиотической активности для биологической борьбы с плесневением семян можно рекомендовать использование штаммов RSA16(1) или RSA20(2).