Эффективность применения коллагеновых мембран для реконструкции полнослойных дефектов гиалинового хряща в эксперименте



Введение. За последнее годы для восстановления полнослойных дефектов гиалинового хряща широкую популярность получила технология индуцированного матрицей аутохондрогенеза - AMIC (autologous matrix indused chondrogenesis) [1,2,3,4]. Технология AMIC основана на формировании отверстий в субхондральной кости (обеспечивающих транспорт костного мозга на поверхность дефекта) и репаративной способности стромальных клеток костного мозга, поступающего через сформированные отверстия. Образующийся в результате этого «суперсгусток» из красного костного мозга стабилизируется коллагеновой мембраной, имплантируемой в зону дефекта хряща. Естественный клеточный каркас защищает и связывает прогениторные клетки внутри «биологической камеры», стимулируя их дифференциацию для репарации хряща [3,5]

Преимущества технологии AMIC очевидны. Это: мало инвазивная одноэтапная процедура, не требующая культивирования хондроцитов; возможность восстановления крупных дефектов хряща (≥ 6-8 см²); простая хирургическая техника; подтвержденная эффективность в отношении купирования болевого синдрома, восстановления функции сустава и удовлетворенности больных исходами лечения.

Несмотря на широкую популярность технологии AMIC, остается много спорных и нерешенных вопросов, а именно: сроки деградации мембраны, характер её трансформации в хрящевую ткань, качество вновь образованной на месте имплантации мембраны хрящевой ткани и др. [6,7]

В настоящее время коллагеновая мембрана является одним из наиболее востребованных биологических материалов для восстановления хрящевой ткани. К сожалению, высокая стоимость импортных коллагеновых мембран не позволяет внедрить технологию AMIC в широкую клиническую практику отечественных медицинских учреждений. В тоже время потребность в выполнении операций по восстановлению хряща остается высокой. Этот факт определил необходимость разработки отечественного аналога, отвечающего всем современным требованиям, предъявляемым клиницистами к коллагеновым мембранам.

Цель исследования: экспериментальным путем изучить биологический потенциал коллагеновых мембран, их способность к трансформации в хрящевую ткань, оценить качество вновь образованной хрящевой ткани.

В работе использовалось два вида коллагеновых мембран, отличающихся по составу, структуре и характеру производства.

В качестве основной, использовалась разработанная российскими учеными мембрана Ortokeep (Рис.1а). Мембрана сформирована методом электроспиннинга из нановолокон диаметром 300-500 нм, состоящих из смеси полилактида и бычьего коллагена I-го типа (Рис.1б). Мембрана имеет одинаковый микрорельеф и смачиваемость с обеих сторон. Метод формирования мембраны и структура нановолокон радикально отличают ее от зарубежных аналогов, что позволяет произвести объективный сравнительный анализ их биологического потенциала.

В качестве контрольной, использовалась коллагеновая мембрана Chondro-Gide, производства зарубежной компании, синтезированная из свиного коллагена I и III типа, который резорбируется естественным путем (Рис.1г). Мембрана имеет двухслойную структуру (Рис.1д). Плотный слой имеет гладкую, не проницаемую поверхность, что обеспечивает стабилизацию сгустка костного мозга на поверхности субхондральной кости и исключает проникновение клеток костного мозга через мембрану в полость сустава. Пористый слой мембраны состоит из рыхлых коллагеновых волокон, способствующих адсорбции клеток в мембрану (Рис.1е). Структура мембраны имеют высокую устойчивости к растяжению, что препятствует её разрыву. Мембрана Chondro-Gide является наиболее популярным биопродуктом и широко используется для восстановления полнослойных дефектов хряща. Именно поэтому данная мембрана была выбрана нами в качестве контрольной.

Модель эксперимента: исследование проводилось на 4-х свиньях породы «русская белая». Настоящее экспериментальное исследование не противоречило этическим нормам и Международным требованиям по гуманному отношению к лабораторным (экспериментальным) животным, а также ГОСТ Р ИСО 10993-1-2009 «Изделия медицинские».

Исследование выполнено с использованием анальгетиков системного действия, применяемых в ветеринарии и клинической медицине в соответствующих для конкретного животного дозировках. Респираторная поддержка при помощи наркозно-дыхательного аппарата осуществлялась путем ингаляции кислородно-воздушной смеси по полузакрытому контуру.

Рис. 1. Внешний вид и строение коллагеновых мембран: а – мембрана Ortokeep; б - нановолокнистая структура мембраны Ortokeep (электронная микроскопия); в - рост клеток на мембране в эксперименте; г – мембрана Chondro-Gide; д - двухслойная структура мембраны Chondro-Gide (электронная микроскопия, увеличение в 100 раз); е - пористая, адгезирующая клетки поверхность мембраны Chondro-Gide (увеличение в 1500 раз).

Рис. 2 Этапы формирования полнослойных дефектов и имплантации коллагеновых мембран (разъяснения см. в тексте). Примечание: 1 – дефект № 1 (имплантация мембраны Ortokeep); 2 – дефект № 2 (имплантация мембраны Chondro-Gide); 3 – дефект № 3 (без имплантации мембраны).

Результаты собственных исследований

На суставах правых задних конечностей каждого животного, с помощью круглого бора формировалось по одному полнослойному дефекту хряща (дефект №1) прямоугольной формы, размером 1х0,5 см, доходящего до субхондральной кости (Рис.2 а). Тонким сверлом диаметром 1,5 мм производилось рассверливание субхондральной кости на глубину 1 см, что позволило обеспечить транспорт костного мозга на поверхность дефекта (Рис.2 б). Коллагеновая мембрана Ortokeep моделировалась по форме и размеру дефектов, и фиксировались к субхондральной кости с помощью фибринового клея (Рис.2 в).

На суставах левых задних конечностей формировали по два дефекта: дефект (№2) – для имплантации мембраны Chondro Gide и контрольный дефект (№3) - без имплантации мембраны (Рис.2 г). Коллагеновая мембрана моделировалась по форме и размеру дефекта. После рассверливания субхондральной кости на дефект №2 наносился фибриновый клей и имплантировалась коллагеновая мембрана Chondro Gide (Рис.2 д). На контрольный дефект №3 имплантация мембраны не осуществлялась (Рис.2 е).

Животные выводились из эксперимента в сроки 2,3,4,6 месяцев после операции. Для последующего гистологического исследования предоставлялись крупные костно-хрящевые фрагменты, с расположенными на них исследуемыми дефектами. Для последующего микроскопического исследования из центральной части каждого дефекта производился забор одного фрагмента-биоптата.

Используя микроскоп с разрешением 12 мегапикселей, с каждого гистологического препарата производили микросъемку препарата, с последующим исследованием: воспалительной реакции, клеточного состава, коллагеновых волокон, остеогенеза. Изучаемые характеристики представлены в таблице.

При макроскопическом исследовании дефекта 3 (без имплантации мембран) отмечалось прогрессирующее увеличение его размеров без признаков регенерации хрящевой ткани на поверхности дефекта (Рис.3). Микроскопическое исследование показало признаки прогрессирующей деструкции костной ткани и отсутствие признаков хондрогенеза. Исходы таких операций были расценены как неудовлетворительные. Именно поэтому мы не будем представлять результаты гистологического исследования биоптатов из зоны дефекта 3, а представим лишь сравнительные с другими группами результаты морфометрии (таблица). Это экспериментальное наблюдение еще раз подтверждает низкую эффективность одной лишь туннелизации субхондральной кости, что ставит под сомнение целесообразность выполнения подобных операций в клинической практике.

Рис.3. Макро препараты на различных сроках после операции.

Примечание: 1 – дефект № 1 после имплантации мембраны

Ortokeep; 2 – дефект № 2 после имплантации мембраны

Chondro-Gide; 3 – дефект № 3 – без имплантации мембран.

В тоже время в экспериментальных группах (дефекты № 1 и 2) выраженного увеличения размеров дефекта не выявлено. Дно дефектов ровное, но не равномерное. При пальпации дна, ткани на ощупь упруго-эластичные. Оба дефекты покрыты жизнеспособной, стабильной хрящевой тканью. (Рис.3)

Микроскопическое исследование дефекта № 1

Рис.4 Микроскопия центральной части дефекта № 1 через 6 месяцев после имплантации мембраны Ortokeep. А-окраска гематоксилином и эозином, х40; Б-окраска гематоксилином и эозином, х100; В-окраска по методу Ван-Гизона, х40; Г- окраска по методу Ван-Гизона, х100.

Примечание: 1 – формирование остеоида (новообразованной костной ткани); 2 – грубоволокнистая соединительная ткань; 3 – адипоциты (жировые клетки); 4 – неохондрогенез (новообразованные хондроциты).

При исследовании гистологических стекол, окрашенных гематоксилином и эозином, во всех сроках вывода, воспалительного процесса, лейкоцитарной инфильтрации, не выявлено. Четкая граница интактного хряща выявлялась до срока 4 месяца, а на 6-м месяце граница стирается. Подлежащая костная ткань подверглась значительной резорбции в непосредственной близости от дефекта. Но признаков остеодистрофии в окружающем губчатом веществе не выявлено. На месте удаленного хряща и резорбированной костной ткани формировалась грубоволокнистая соединительная ткань. Начиная с 1-го месяца наблюдалось образование и созревание соединительной ткани и как следствие уменьшения ее объема (табл.). Параллельно по краям дефекта костной ткани происходили активные репаративные процессы – неостеогенез. Дефект первоначально имел колбообразную форму, но в дальнейшем приобретал цилиндрическую форму и к 6 месяцам становился клиновидным. Причем если с 1 месяца до 4 месяца дефект в основном был заполнен грубой волокнистой тканью, то на 6 месяце дефект практически полностью закрылся костной тканью. Формирование неохондроцитов (хонрогенез) проис- ходило активно и не только у края неповрежденного хряща, также выявлялись островки хондроцитов по центру дефекта (Рис. 4). В центре дефекта имелось глубокое щелевидное пространство, уходящее относительно глубоко в губчатое вещество. Процессы неоангиогенеза выраженные. Результаты морфометрии представлены в таблице.

Таким образом, при гистологическом исследовании центральной части образца дефекта № 1 выявлены активные репаративные процессы, направленные на восстановление резорбированной костной ткани, закрытие дефекта, а также восстановление гиалинового хряща. Причем, хондрогенез протекал не только по краю неповрежденного хряща, но и в виде отдельных островков в толще соединительной ткани.

Микроскопическое исследование дефекта № 2

Рис.5 Микроскопия центральной части дефекта № 2 через 6 месяцев после имплантации мембраны Chondro-Gide. А-окраска гематоксилином и эозином, х40; Б-окраска гематоксилином и эозином, х100; В-окраска по методу Ван-Гизона, х40; Г- окраска по методу Ван-Гизона, х100.

Примечание: 1 – формирование остеоида (новообразованной костной ткани); 2 – грубоволокнистая соединительная ткань; 3 – адипоциты (жировые клетки); 4 – неохондрогенез (новообразованные хондроциты).

При исследовании гистологических стекол, окрашенных гематоксилином и эозином, воспалительного процесса, лейкоцитарной инфильтрации, не выявлено. Граница разрушенного хряща нечеткая. По центру сформировалась щелевидная полость, образованная на месте дефекта, подлежащая костная ткань подверглась резорбции (глубина резорбции несколько уменьшилась по сравнению с 3-х месячным результатом), на месте резорбированной костной ткани сформировалась грубоволокнистая соединительная ткань, с тенденцией к образованию костной ткани по краю дефекта и множественными островками хондроцитов в толще дефекта. Дефект имел колбообразную форму, и формирование неохондроцитов происходило активнее в направлении от периферии к центру. Имелсь отдельные щелевидные полости в толще грубоволокнистой соединительной ткани. На дне дефекта между соединительной тканью и костной тканью сформировалась довольно выраженная прослойка, состоящая из жировых клеток. Процессы неоангиогенеза выраженные. Также в толще соединительной ткани формировались островки хондроцитов. Результаты морфометрии представлены в таблице.

Таким образом, при гистологическом исследовании центральной части образца из дефекта № 2 отмечены ускоренные репаративные процессы, формирование островков хрящевой ткани в непосредственной близости к суставной поверхности. Также отмечены изменения глубины дефекта. Из негативных моментов отмечается образование прослойки жировых клеток между соединительно-тканной мозолью и костной тканью. А также наличие щелевидной полости.

Таблица 1

Размерные характеристики гистологического строения центра дефекта при различных видах вмешательств

	Группа	2 месяца (M±m)	3 месяца (M±m)	4 месяца (M±m)	6 месяцев (M±m)
Толщина интактного хряща, мкм	Контроль	734,0±16,12	2247,5±36,94	2359,8±38,79	842,10±21,23
	Chondro-Gide	1118,5±21,81	1230,4±23,99	1291,9±25,19	838,67±19,12
	Ortokeep	1519,0±38,42	1670,5±42,26	1341,3±25,08	886,35±10,44
Толщина хряща в центре вмешательства,	Контроль	0,0	0,0	0,0	0,0
мкм	Chondro-Gide	0,0	503,9±22,74	571,4±29,96	252,68±12,19
	Ortokeep	0,0	534,0±36,42	657,1±34,46	335,94±13,47
Толщина соединительной ткани в области	Контроль	1635,2±187,33	1152,2±124,80	1094,6±118,56	2406,98±178,05
имплантации, мкм	Chondro-Gide	1648,2±137,34	1615,2±134,60	1534,5±127,87	900,58±72,43
	Ortokeep	2072,0±339,89	1968,6±322,90	2905,7±204,92	1688,66±71,60
Толщина кортикальной пластинки в	Контроль	162,9±6,33	121,9±7,27	134,0±8,00	53,22±4,08
интактной области, мкм	Chondro-Gide	162,2±8,37	181,6±9,38	199,8±10,32	102,18±6,60
	Ortokeep	181,0±9,92	198,6±10,91	226,0±12,03	84,53±5,15
Толщина кортикальной пластинки в цен-	Контроль	121,6±7,73	96,8±5,53	106,5±6,08	147,54±18,67
тре вмешательства, мкм	Chondro-Gide	140,4±13,67	157,3±15,31	173,0±16,84	184,76±5,48
	Ortokeep	149,0±11,01	164,4±12,11	163,9±14,81	142,66±19,93
Объем костной ткани, %	Контроль	18,9±0,63	18,5±0,62	20,4±0,68	10,42±0,67
	Chondro-Gide	16,3±028	19,2±0,33	21,1±0,36	17,41±0,36
	Ortokeep	27,0±0,67	29,8±0,73	27,1±0,57	30,23±0,34
Объем хрящевой ткани, %	Контроль	15,4±0,51	22,4±0,74	24,6±0,82	10,64±0,38
	Chondro-Gide	23,1±0,29	25,8±0,33	28,4±0,36	15,04±0,72
	Ortokeep	27,0±0,57	29,4±0,63	32,1±1,88	19,99±0,43
Объем соединительной ткани, %	Контроль	53,3±0,70	52,3±0,69	44,4±0,58	13,31±1,04
	Chondro-Gide	53,2±0,50	40,4±0,48	34,4±0,41	17,03±0,56
	Ortokeep	43,0±0,47	33,7±0,47	31,2±0,46	18,19±0,53
Объем кровеносных сосудов, %	Контроль	5,8±0,16	7,1±0,20	6,8±0,19	8,39±0,42
	Chondro-Gide	7,5±0,45	8,9±053	8,4±0,50	11,91±0,42

Выводы. Подводя итог, хотим отметить, что оба исследуемых материала (коллагеновые мембраны Ortokeep и Chondro-Gide) показали отличные результаты в регенерации полнослойного дефекта хряща. В обеих группах были получены практически идентичные макро и микроскопические результаты. Однако более детальный анализ данных гистологического исследования выявил следующие особенности:

• •    В обеих группах зона имплантации коллагеновых мембран была представлена волокнистой соединительной тканью с включениями хондроцитов.

• •    Коллагеновые мембраны в месте дефекта создавали более благоприятные условия для репаративных процессов, что подтверждается самыми короткими сроками закрытия дефекта собственной соединительной тканью. Созревание соединительной ткани протекало в более короткие сроки.

• •    В зоне имплантации мембран хондрогенез протекал по «рассыпному» типу – в сформированной грубоволокнистой соединительной ткани появлялись «островки» гиалинового хряща. Данные островки первоначально располагались на удалении друг от друга, но имели тенденцию к слиянию между собой. И процессы неохондрогенеза протекали не только на границе со здоровой тканью, но и в толще соединительнотканной мозоли.

• •    Эффективность применения коллагеновых мембран подтверждается цифровыми значениями объема костной и хрящевой тканей.

Таким образом, проведенное исследование подтвердило высокую эффективность коллагеновых мембран для регенерации хрящевой ткани. В тоже время считаем важным изучить данные с более отдаленными сроками исследованиями. Также, были бы весьма ценными исследования с различными по составу мембранами, что является предметом нашей дальнейшей работы.