Эффекты фабоматизола в условиях свинцовой интоксикации в эксперименте у крыс

Изучение механизмов негативного влияния экотоксикантов на здоровье человека не перестает быть актуальной проблемой для отечественных и зарубежных ученых. Среди ксенобиотиков отдельное место занимают тяжелые металлы и их соединения, содержание которых в экосистеме, по данным систематического мониторинга Роспотребнадзора в стране, зачастую превышает уровень предельно допустимой концентрации. В этой группе свинец занимает особое место, таккак является поливалентным ядом, по мнению Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ). Систематизация данных между- народной деятельности по защите живых систем от химических веществ определяет приоритетность изучения механизмов влияния, учитывая их распространенность в экосистеме [1–4]. Анализируя эффекты действия соединений свинца на животных и человека, следует отметить следующие факторы: уровень загрязнения экосистемы, стойкость, способность к накоплению в биосфере и, соответственно, высокий уровень риска кумуляции в живом организме [5, 6].

Как правило, свинец накапливается в сосудистой системе, аорте и жизненно важных органах: в почках и печени. Вызывая гипоксию, ацетат свинца индуцирует развитие оксидативного стресса и нарушение продукции оксида азота (NOх) как основного вазодилататора. Развивается патологический процесс – дисфункция эндотелия, приводящая к повышению тонуса сосудов, вазоконстрикции и гипертензии. Кроме этого, в условиях окислительного стресса происходит повреждение клеток внутренних органов, в частности почек и печени. Экспериментально доказано, что хроническое воздействие свинца приводит к его накоплению в почках, нарушению их структуры и функции [7]. Анализируя изменение функционального состояния почек под влиянием свинца, выявляется его диуретическое и натрийуретическое действие из-за снижения канальцевой реабсорбции воды и натрия. Важная роль при токсическом поражении почек отводится Na,K-АТФ-азе как компоненту Na-транспортирующей системы, определяющей обратный транспорт ионов в канальцах почек [8].

На основании данных литературы об участии окислительного стресса в механизмах токсичности ацетата свинца ряд исследователей предложили использовать вещества с антиоксидантными и противовоспалительными свойствами для нейтрализации его негативных проявлений [9–11]. Существуют многочисленные данные о позитивном влиянии фабоматизола, в том числе результаты деятельности ученых НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН [12]. Известно положительное влияние препарата на соотношение индуцибельной и эндотелиальной NO-синтаз. При этом фабоматизол, тормозя деятельность индуцибельной NO-синтазы (NOS-2), повышает функциональную активность эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) [13]. Вышеизложенное послужило основанием для проведения данного исследования.

Цель исследования: изучение механизмов влияния фабоматизола на характер изменений окислительно-восстановительных реакций, NO-образующую функцию эндотелия, обмен холестерина и функциональные показатели у крыс при свинцовой интоксикации.

Материал и методы

Эксперимент проведен на крысах линии Wistar в возрасте одного года, весом 230–250 г ( n = 60). Подопытные животные находились в виварии, и их содержание соответствовало Правилам проведения работ с ними (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР № 755 от 12.03.1977 г.). Для выбора дозировки ацетата свинца мы предварительно определяли DL₅₀ и затем постепенно уменьшали дозу вводимого вещества до получения той минимальной концентрации, которая способна вызывать изменения изучаемых параметров.

Животных в количестве 20 голов включили в контрольную группу; 2-ю группу составили животные (20 голов) с введением ацетата свинца (5 мг/кг веса животного) в течение 30 дней; животные 3-й основной группы получали фабоматизол в дозе 10 мг/кг 30 дней по окончании интоксикации (20 голов). После интоксикационного периода и последующего введения фабоматизола у крыс забирали образцы крови и тканей. В плазме крови, гомогенатах почечной и печеночной тканей определяли концентрацию диальдегида малоновой кислоты (МДА), а также концентрацию церулоплазмина (ЦП), активность супероксиддисмутазы (СОД), каталазы. Об изменении холестеринового обмена (ХС) судили по данным общего ХС (ОХС) и липопротеиновых фракций: липопротеинов низкой (ЛПНП) и высокой плотности (ЛПВП). Содержание суммарных метаболитов NOх исследовали в моди- фикации В.А. Метельской (цит. по С.Г. Дзугкоеву) [14], а также экспрессию эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) в эндотелии аорты методом Вестерн-блотта. Функциональное состояние Na+,K+-АТФ-азы в почечной и печеночной тканях определяли методом Т.С. Scou (1957). О состоянии гепатоцита судили по данным активности органоспецифических ферментов в плазме крови: аланинаминотрансферазы (АлАТ), аспартатаминотрансферазы (АсАТ), гамма-глутамилтранспептидазы (ГГТП) и экскреторного энзима – щелочной фосфатазы.

С помощью программы Microsoft Excel 2006 и пакета STATISTICA 6.0 проводили статистическую обработку результатов, которые представили в виде среднего значения ( M ) и ошибки среднего (± m ). Достоверность различий определяли по t -критерию Стьюдента, проверяли статистическую достоверность различий между группами и считали p < 0,05 уровнем статистической значимости. Коэффициенты корреляции определяли по Пирсону.

Результаты и обсуждение

При систематической интоксикации, вызванной экспозицией ацетатом свинца в дозе 5 мг/кг веса тела животного в течение 30 дней, выявлены метаболические и функциональные нарушения. Следует отметить, что свинец, ингибируя гемовую группу гемоглобина, способствует развитию анемии и гипоксии тканей внутренних органов. В этих условиях активируется образование активных метаболитов кислорода (АМК), индуцирующих развитие процесса липопероксидации в мембранах эритроцитов и клетках внутренних органов.

Данные показали повышение содержания МДА в гемолизате эритроцитов, клетках коркового и мозгового слоев интерстиция почек и гепатоците. Наряду с АМК развитию окислительного стресса способствовало нарушение ферментативной составляющей антиоксидантной системы (АОС). Полученные результаты свидетельствуют о снижении активности СОД в эритроцитах и повышении уровня каталазы и ЦП в плазме крови.

Нужно учитывать, что повышенные данные активности каталазы и концентрации ЦП являются проявлением компенсаторной реакции в условиях свинцовой интоксикации. Окислительный стресс при сатурнизме сопровождается уменьшением концентрации NOх в плазме крови подопытных крыс. В изменении продукции NO могут играть роль следующие факторы: наличие аминокислоты L-аргинина, его модифицированного аналога, уровня экспрессии еNOS, а также снижение биодоступности L-аргинина как регулятора еNOS.

Поскольку доступность L-аргинина для эндотелиоцита и NO-синтазы определяется функционированием транспортного механизма и влиянием атерогенных ЛПНП, мы изучали состояние метаболизма холестерина при интоксикационном синдроме. Наши данные свидетельствуют о повышенном уровне ОХС и ХС ЛПНП, тогда как ХС ЛПВП был достоверно снижен. Окислительно-модифицированные ЛПНП становятся фактором риска развития атерогенных изменений в эндотелии сосудов и нарушенного транспортного механизма для субстрата eNOS–L-аргини-на. Дефицит L-аргинина и нарушение его биодоступности могут быть факторами нарушенной экспрессии еNOS. Данные показали снижение уровня экспрессии еNOS в эндотелии аорты крыс в среднем на 58,2% под влиянием ацетата свинца.

Исходя из сведений литературы, причинами, способствующими нарушению уровня экспрессии еNOS и функциональной активности фермента, являются окисленное состояние кофакторов, особенно тетрабиоптерина (ВН4), вызывающих разобщение в молекуле еNOS и снижение продукции NO de novo [15]. Совокупность биохимических изменений: процесс ПОЛ, дефицит NOх, нарушение обмена ХС могут быть причиной изменения микроцир-куляторной гемодинамики в нефроне и функции почек. Результаты исследования показали снижение уровня канальцевой реабсорбции натрия и активности Na-транс-портирующего фермента Na⁺,K⁺-АТФ-азы в корковом и мозговом веществе почек.

Для коррекции выявленных метаболических и функциональных нарушений применяли фабоматизол, созданный научными сотрудниками Института фармакологии РАМН им. В.В. Закусова. Данные показали положительный эффект фабоматизола: уменьшение уровня ОХС, снижение содержания ХС ЛПНПи повышение ХС ЛПВП в крови (табл. 1). На основании анализа результатов можно предположить, что анксиолитик, препятствуя окислительным процессам, восстанавливает молекулярную структуру цитоплазматических мембран, встраивая в них сигма1-ре-цепторы. При этом препарат одновременно повышает афинность рецепторов ЛПНП и транспорт ХС в клетки.

Внутримышечное введение фабоматизола при интоксикационном синдроме в течение 30 дней выявило статистически достоверное снижение уровня липопероксида-ции по данным содержания МДА в эритроцитах, почечной и печеночной тканях. Анализ результатов влияния анксиолитика на ПОЛ свидетельствует о проявлении его антиоксидантного действия. Причем противодействие фабо-матизолом активности окислительных процессов было обусловлено ферментативной составляющей антиоксидантной защиты (АОЗ) клеток. Статистически достоверно повысилась активность СОД, а каталазы и концентрация ЦП снизились, но остались повышенными сравнительно с нормативными данными (см. табл. 1).

Таблица 1. Метаболические показатели крови, почечной и печеночной тканей на фоне фабоматизола при свинцовой интоксикации у крыс

Table 1. Metabolic parameters of blood, kidney and liver tissues against the background of fabomatizol in lead intoxication in rats

Показатели Parameters	Контроль Control	Ацетат свинца Lead acetate	Ацетат свинца + фабоматизол Leadacetate + fabomotizole
МДА, эритроциты, нмоль/мл MDA, erythrocytes, nmol/ml	4,74 ± 0,016	6,32 ± 0,0151111	5,33 ± 0,012222
МДА, корк. вещество, нмоль/мг белка MDA, cortex, nmol/mg protein	3,18 ± 0,22	5, 54 ± 0,0141111	4,76 ± 0,0082222
МДА, мозг. вещество, нмоль/мг белка MDA, medulla, nmol/mg protein	4,28 ± 0,13	5,19 + 0,0091111	4,13 ± 0,0082222
МДА, печень, нмоль/мг белка MDA, liver, nmol/mgprotein	1,763 ± 0,05	3,37 ± 0,071111	2,51 ± 0,092222
СОД, эритроциты, усл.ед. SOD, erythrocytes, r.u.	88,2 ± 1,65	54,94 ± 0,081111	69,42 ± 0,022222
Каталаза, сыворотка крови, мкат/л Catalase, bloodserum, mkat/l	225,56 ± 5,51	382,36 ± 3,11111	299,15 ± 0,532222
ЦП, сыворотка крови, мг/л CP, bloodserum,mg/l	338,66 ± 10,4	432,29 ± 1,141111	385,41 ± 0,202222
NOx, сыворотка крови, мкМ NOx, bloodserum, µM	50,95 ± 0,65	28,38 ± 0,321111	40,61 ± 0,0012222
ОХС, ммоль/л Total cholesterol, mmol/l	1,88 ± 0,033	4,67 ± 0,0091111	3,32 ± 0,012222
ХС ЛПВП, ммоль/л HDL cholesterol, mmol/l	0,673 ± 0,01	0,27 ± 0,0061111	0,64 ± 0,0082222
ХС ЛПНП, ммоль/л LDL cholesterol, mmol/l	1,098 ± 0,026	4,15 ± 0,011111	2,57 ± 0,012222

Примечание: МДА – малоновый диальдегид, СОД – супероксиддисмутаза, ЦП – церулоплазмин, NOx – суммарные метаболиты оксида азота, ОХС – общий холестерин, ЛПВП – липопротеины высокой плотности, ЛПНП – липопротеины низкой плотности.¹¹¹¹ р < 0,001 – достоверность относительно контроля; ²²²² р < 0,001 – достоверность ацетата свинца + фабоматизол относительно ацетата свинца.

Note: MDA – malondialdehyde; SOD – superoxide dismutase; CP – ceruloplasmin; NOx – total nitric oxide metabolites; HDL – high density lipoprotein, LDL – low density lipoprotein. ¹¹¹¹ р < 0,001 < 0.001 – significance relative to control; ²²²² р < 0,001 – significance of lead acetate + fabomatizol relative to lead acetate.

Фермент каталаза является функционально более востребованным, так как пероксид является продуктом деятельности многих химических реакций. Повышенная активность каталазы является проявлением компенсаторной реакции в условиях интоксикации ацетатом свинца. Наши результаты перекликаются с данными исследователей из НИИ фармакологии РАМН, которые показали способность фабоматизола ингибировать оксидативный стресс на клетках головного мозга [16].

Данные, приведенные в таблице 1, демонстрируют влияние фабоматизола на активность процесса ПОЛ и ферментативную составляющую АОЗ клеток. Повышенная функциональная активность СОД способствует снижению уровня супероксид-анион радикала и образованию пероксида. Происходит устранение дисбаланса между ферментами АОС под влиянием фабоматизола и повышение уровня NOx в крови (см. табл. 1). Изменения, характеризующие метаболизм NОх, указывают на эффективность анксиолитика. Оценка корреляционной связи между активностью СОД, уровнем NO и концентрацией МДА показала наличие отрицательной связи (r = –0,58; r = –0,66; р < 0,001).

Таким образом, полученные данные являются вполне доказательными, свидетельствуют об ингибирующем влиянии фабоматизола на перекисное окисление и перекликаются со сведениями литературы. Коррекция фа-боматизолом окислительно-восстановительных реакций и обмена ХС способствовала повышению уровня NOх в плазме крови.

Для убедительности этого положения был проведен анализ взаимодействия между липопротеиновыми фракциями и гомеостазом NOх, который показал, что между показателями ОХС, ХС ЛПНП, концентрацией NOх существует отрицательная связь ( r = –0,58; r = –0,61). Восстановление обмена ХС и противодействие окислительным процессам приводит к возрастанию уровня и доступности L-аргинина для еNOS и, соответственно, повышению содержания NOх. Такого плана исследования представлены в литературе; в них установлено, что экспрессия

NOS-3 снижается при повышении содержания МДА [17]. Полученные данные показали снижение концентрации МДА в слоях интерстиция почек и печени под влиянием фабоматизола.

Таким образом, анализ результатов позволяет утверждать о противодействии фабоматизола процессу ПОЛ в эритроцитах, клетках почечной и печеночной тканей, способствуя повышению антиоксидантного статуса и одновременно содержания NOх (см. табл. 1). На фоне фабоматизола происходит позитивный сдвиг в мембранах почечных и печеночных клеток, восстановление липид-липидных и липид-белковых взаимодействий. Показателем этих изменений в клетках внутренних органов являются данные функциональной активности Na,K-АТФ-азы, которые демонстрируют позитивный эффект действия препарата фабоматизола (табл. 2).

Таблица 2. Влияние фабоматизола на активность Na,K-АТФ-азы в клетках органов и уровень органоспецифических ферментов в плазме крови при свинцовой интоксикации у крыс

Table 2. Effect of fabomatizole on the activity of Na,K-ATPase in organ cells and the level of organ-specific enzymes in blood plasma during lead intoxication in rats

Показатели Parameters		Контроль Control	Ацетат свинца Lead acetate	Ацетат свинца + фабоматизол Leadacetate + fabomotizole
Na,K-ATФ-aзa (мкмольРн/мг белка/час) Na,K-ATP-aza (µmolRn/mgprotein/h)
	почка (корковый слой) kidney (cortex)	4,39 ± 0,18	1,307 ± 0,0061111	2,31 ± 0,0882222
	почка (мозговой слой) kidney (medulla)	6,62 ± 0,35	3,35 ± 0,061111	4,23 ± 0,072222
	печень liver	1,31 ± 0,037	0,36 ± 0,0051111	0,76 ± 0,082222
АлАТ, мкмоль/с*л ALT, µmol/s*l		1,13 ± 0,027	1,98 ± 0,0161111	1,572 ± 0,0142222
АсАТ, мкмоль/с*л AST, µmol/s*l		1,06 ± 0,03	2,69 ± 0,0311111	1,705 ± 0,0192222
ГГТП, нмоль/с*л GGTP, nmol/s*l		535,78 ± 53,32	1678,1 ± 1,1841111	1089,85 ± 0,7692222
ЩФ, нмоль/с*л AP, nmol/s*l		348,05 ± 15,51	835,4 ± 0,6491111	532,14 ± 0,8572222

Примечание: АлАТ – аланинаминотрансфераза, АсАТ – аспартатаминотрансфераза, ГГТП – гамма-глутамил-транспептидаза, ЩФ – щелочная фосфатаза. 1111) – р < 0,001 – достоверность относительно контроля; 2222) – р < 0,001 – достоверность ацетата свинца + фабоматизол относительно ацетата свинца.

Note: ALT– alanine aminotransferase, AST– aspartate aminotransferase, GGTP – gamma-glutamyltranspeptidase, AP– alkaline phosphatase.1111) – p < 0.001 – significance relative to control; 2222) – р < 0.001 – significance of lead acetate + fabomatizol relative to lead acetate.

Корреляционный анализ функциональной активности АТФ-азы, активируемой Na и K и МДА, выявил наличие отрицательной связи данных в корковом и мозговом слоях почек ( r = –0,82; r = –0,78).

Заключение

Свинцовая интоксикация вызывает нарушение окислительно-восстановительных реакций: снижает антиоксидантный статус, ингибирует активность СОД, повышает интенсивность липопероксидации в эритроцитах и почечной ткани. Окислительный стресс вызывает снижение содержания NOх и его биодоступности вследствие нарушенного обмена ХС. Атерогенные ЛПНП, вызывающие структурные изменения в эндотелии сосудов, способ- ствовали снижению доступности L-аргинина для eNOS. Данные свидетельствуют о пониженном уровне экспрессии eNOS при свинцовой интоксикации, продукции NOх, о нарушении гемодинамики в нефроне и гепатоците. Проявлением функциональных нарушений является угнетение активности Na-транспортирующего фермента – Na,K-АТФ-азы в клетках коркового и мозгового слоев почек, а также в печени.

Для коррекции выявленных нарушений использовался препарат фабоматизол, который вводили в/м в течение 30 дней после интоксикации ацетатом свинца. Результаты проведенной работы продемонстрировали антиоксидантные свойства фабоматизола при свинцовой интоксикации по данным снижения содержания диальдегида малоната в крови, почечной, печеночной тканях и повышения активности ферментов АОС. Эти антиоксидантные свойства фабоматизола способствовали возрастанию уровня образования NOх. Другим вспомогательным фактором, повышающим биодоступность L-аргинина для eNOS, оказалось восстановление обмена ХС. Возможно предположить влияние фабоматизола на уровень экспрессии eNOS, что ранее в других условиях также было установлено исследованиями сотрудников лаборатории.