Экдистероидсодержащие растения национального парка Кук Фыонг (Северный Вьетнам)

Во Вьетнаме остро стоит проблема улучшения качества жизни людей, в частности, проблема увеличения профессионального долголетия. В этих целях все большее применение находят адапто-генные средства, содержащие фитоэкдистероиды – полигидроксилированные стерины, являющиеся рас- тительными аналогами гормонов линьки насекомых. Будучи не токсичными для млекопитающих и человека и не оказывая на них гормонального действия, фитоэкдистероиды благоприятно влияют на углеводный, липидный и белковый обмен, повышают сопротивляемость организма к стрессу и неблагоприятным факторам среды, увеличивают силу и выносливость людей, ускоряют восстановление после высокой физической и психической нагрузки [1]. Ранее в Институте биологии Коми НЦ УрО РАН была создана линия биологически активных добавок к пище, которые содержат очищенные экдисте-роиды, выделенные из листьев растения серпухи венценосной (Serratula coronata L., Asteraceae); «Кардистен», рекомендованный для профилактики ишемической болезни сердца и реабилитации в после инфарктный период, «Диастен» – для профилактики диабета II типа и «Адастен» – для повышения физической и умственной работоспособности и устойчивости к стрессу [2].

Ранее с использованием современных методов хемотаксономии и молекулярной филогенетики нами были выявлены закономерности распространения экдистероидов в царстве растений, что позволило разработать научно обоснованный прогноз обнаружения фитоэкдистероидов в географически удаленных флорах [3]. Флора Вьетнама насчитывает свыше 12 тыс. видов растений, среди которых более 2 тыс. видов являются пищевыми и лекарственными, однако систематических исследований растений флоры Вьетнама на содержание экдистероидов не проводилось. Целью настоящей работы было выявление практически важных видов экдистероидсо-держащих растений во флоре Северного Вьетнама в качестве ресурсных видов для нужд фармацевтической и пищевой промышленности.

Район, объекты и методы исследования

Территория Вьетнама вытянута в меридиональном направлении на расстояние, более чем на 1750 км, что обусловливает разнообразие климатических и природных условий и, как следствие, су- щественные отличия в видовом составе флор северной, центральной и южной части Вьетнама. В виду значительной антропогенной трансформации природной флоры Вьетнама (в особенности на равнинных территориях Северного Вьетнама вследствие их сельскохозяйственного освоения) исследования проводились нами на территории Национального парка Кук Фыонг, расположенного в северной части страны. Национальный парк Кук Фыонг расположен на восточном крае известняковой горной цепи, берущей начало на плоскогорье Шонла Северного Вьетнама. В парке площадью 220 км2 преобладают первичные тропические известняковые леса (фото 1), где встречаются 1980 видов сосудистых растений из 887 родов и 221 семейства. Ведущие семейства флоры парка – Euphorbiaceae, Poaceae, Fabaceae, Rubiaceae, Asteraceae, Mora-ceae, Lauraceae, Cyperaceae, Orchidaceae и Acan-thaceae [4].

Объектами исследований являлись дикорастущие виды растений флоры Северного Вьетнама. Выявление мест произрастания растений проводили во время серии маршрутных экспедиций в северной части Вьетнама в октябре 2015 г. на территории Национального парка Кук Фыонг. Указывали приуроченность местообитаний растений к элементам рельефа и типам растительности, выполнены краткие геоботанические описания (фото 2).

Для анализа отбирали разные части растений на разных фазах развития. Растительный материал фиксировали путем высушивания в бумажных пакетах при температуре 60°С. Методика ВЭЖХ-анализа растительных образцов : измельченную растительную пробу 50–100 мг (точная

Фото 1. Панорама Национального парка Кук Фыонг . Фото В.В. Володина.

Photo 1. Panorama of the National Park Cuc Phuong. Photo by V.V.Volodin.

Фото 2. Отбор образцов растений для биохимического анализа. Наибольшее количество экдистероидов обнаружено в коре дерева Vitex quinata. Фото С.О.Володиной .

Photo 2. Plant sampling for biochemical analysis. The maximum content of ecdysteroids was found in the bark of Vitex quinata tree. Photo by S.V.Volodina.

навеска) экстрагировали 3 мл 60 %-ного метанола при 25 ^°С в течение 16 ч. Экстракт освобождали от взвешенных частиц путем центрифугирования (12000 об./мин, 25 мин.). Затем отбирали 1 мл экстракта и разбавляли 2 мл воды. Разбавленный экстракт (3 мл) пропускали через концентрирующий патрон Диапак С 16 (ЗАО "БиоХимМак", Россия). Эк-дистероиды смывали с патрона 60 %-ным метанолом (3 мл). Перед вторичным использованием патрон промывали чистым метанолом (5 мл), а затем стабилизировали 20 %-ным раствором метанола (3 мл). Анализ проводили независимо в двух лабораториях. В России – в лаборатории биохимии и биотехнологии Института биологии Коми НЦ УрО РАН (г. Сыктывкар) на аналитической системе ВЭЖХ "Varian", "Pro Star" (США). Состав элюента: вода – ацетонитрил (100:20), скорость потока элюента 1,5 мл/мин; λ = 242 нм; колонка Кromasil C 18 (150x4мм). Во Вьетнаме – в Институте тропической медицины Российско-Вьетнамского тропического научно-исследовательского и технологического центра (г. Ханой) на аналитической системе Agilent 1200 (США). Состав элюента: вода – ацетонитрил (100:20), скорость потока элюента 1 мл/мин; λ = 242 нм; колонка XDB-C18 (5 мкм, 4,6x150 мм).

Результаты исследований

Учитывая высокий уровень биоразнообразия флоры Вьетнама, было совершенно очевидно, что без знания закономерностей распространения эк-дистероидов среди сосудистых растений, их обнаружение в растениях, произрастающих на изучаемой территории, было бы маловероятным и весьма затруднительным. При изучении распространения важнейших классов биологически активных веществ среди растений успешно применяется принцип филогенетического родства. Например, было показано, что обнаружение алкалоидов наиболее вероятно в семействах Ranunculaceae и Rutaceae, оксиметилантрахинонов – в семействах Polygona-ceae и Rhamnaceae, кумаринов – в семействах Apiaceae и Rutaceae. Эти же принципы лежат и в основе внутрисемейственного поиска [5]. Однако в литературе длительное время господствовала устойчивая точка зрения об отсутствии закономерностей в распространении экдистероидов в царстве растений и отсутствии филогенетических связей между видами-продуцентами экдистероидов на том лишь основании, что экдистероидсодержащие растения были обнаружены как в филогенетически близких, так и далеко отстоящих друг от друга таксонах [6]. В то же время, анализируя доступные в литературе данные о встречаемости экдистероидов в царстве растений, нами было высказано мнение, что закономерности распространения экдистерои-дов прослеживаются на внутрисемейственном уровне в трибах. В семействе Caryophyllaceae экдисте-роиды найдены в видах растений из родов Silene и

Lychnis – оба принадлежат трибе Lychnideae; в представителях триб Alsineae и Diantheae этого же семейства экдистероиды не были обнаружены. Эта закономерность оказалась характерна и в семействах Chenopodiaceae, Amaranthaceae и некоторых других. В больших семействах признак экдистеро-идности закреплен в подтрибах, например, в семействе Asteraceae – в подтрибе Centaurineae. Следует отметить, что это правило не носит абсолютный характер, и на таком этапе обобщения имеющихся данных отклонения от него можно объяснить следующими причинами: 1) несовершенством ранее применяемых методик анализа; 2) некоторой искусственностью таксономического ранга «триба» в существующих системах классификации; 3) возможной эволюционно обусловленной утратой способности к синтезу экдистероидов некоторыми видами из «положительных» родов и триб. В то же время принцип «положительных триб» был успешно реализован нами при скрининге растений флоры европейского Северо-Востока России [7].

В соответствии с этим прогнозом, мы обнаружили экдистероиды в трех видах рода Strobi-lanthes (Acanthaceae), Achyranthеs bidentata Blume и Cyathula prostrata (L.) Blume (Amaranthaceae), Dracontomelon duperreanum Pierre (Anacardiaceae), трех видах рода Ilex (Aquifoliaceae), Crateva nurvala Buch.-Ham. (Capparaceae), Ipomoea congesta R.Br. (Convolvulaceae), двух видах рода Sida (Malvaceae), Averrhoa carambola L. и Oxalis corymbosa DC (Oxalidaceae), трех видах рода Zantoxylum (Rutaceae), трех видах рода Vitex (Verbenaceae). В целом экди-стероиды были обнаружены в 23 видах растений, произрастающих на территории Национального парка Кук Фыонг (таблица).

Следует отметить, что содержание экдисте-роидов в растениях этих видов варьирует в очень широком интервале концентраций. Среди них имеется небольшая группа растений с высоким содержанием 20-гидроксиэкдизона (20Е) (до 2 и более процентов): это виды рода Vitex (Verbenaceae), два вида рода Sida (Malvaceae) и Dracontomelon duperreanum . Самое высокое содержание экдисте-роидов обнаружено в коре дерева Vitex quinata (Lour.) F.N.Williams (2,7 %). Кора этого дерева может служить сырьем для получения очищенной эк-дистероидной субстанции. Сырье других видов из этой группы растений может использоваться для получения галеновых препаратов (препаратов на основе суммарных экстрактов растений), поскольку выделение очищенных субстанций может оказаться экономически невыгодным.

Необходимо отметить тот факт, что вопреки имеющимся в литературе данным, полученным с помощью биотестов на личинках насекомых, нами не было подтверждено наличие экдистероидов в растениях Amaranthus lividus и Coix lacrima-jobi . Причина получения противоречивых данных могла заключаться в ошибочных результатах биотеста, которыми пользовались исследователи в 60–70-х гг. ХХ в., когда о наличии фитоэкдистероидов, обладающих активностью гормонов линьки насекомых, судили по помутнению кутикулы личинок при погружении в растительные экстракты. По этой же причине, вероятно, мы ошибочно искали экдисте-роиды в сем. Araceae, Araliaceae и Myrsinaceae.

Экдистероидсодержащие растения в практике народной и научной медицины Вьетнама: прошлый и современный опыт

По итогам наших исследований, несомненно, большой интерес представляло выяснить использование в практических целях растений, в которых нами обнаружены экдистероиды. Оказалось, что настойка из коры дерева Vitex quinata повышает аппетит и улучшает пищеварение. Ее используют при ревматизме и чесотке. Кору варят и пьют как чай или настаивают в спирте как тонизирующее средство. Известно об использовании отвара листьев дерева Dracontomelon duperreanum для заживления ран. Во Вьетнаме производится препарат «Тайантин» для избавления от курения, в состав которого, кроме экстракта Dracontomelon duperrea-num , входит экстракт карамболы ( Averrhoa carambola ), в листьях которого мы также обнаружили небольшие количества экдистероидов [8]. Лечебные свойства растений рода Sida известны в Индии более 5 тыс. лет, где ее называют Маха Бала и считают эликсиром молодости. В научной медицине это растение используют как психостимулятор и общеукрепляющее средство для снятия хронической усталости. Оно применяется при лечении онкологических заболеваний, является укрепляющим средством до и после химиотерапии. Используется как анаболик для наращивания мышечной ткани, улучшения кровообращения, очищает кровь, нормализует сахар в крови, способствует потере избыточного веса, улучшает обмен веществ. Это растение сейчас широко используется в косметических продуктах – кремах для лица и тела, тониках, лечебных мазях и бальзамах, масках и маслах.

Результаты анализа образцов растений, собранных в Национальном парке Кук Фыонг, на содержание 20Е

The results of the analysis of plant samples collected in the National Park Cuc Phuong for the content of 20E

Вид (номер образца)	Место сбора; экологические условия	Часть растения	Содержание 20Е, %
Сем. Acanthaceae
Strobilanthes multangulus Benoist (38)	По дороге из Центра Бонг, 200 м на север, не доезжая до станции лесников N 9; 20º16′562" с.ш., 105º40′868" в.д., высота 226 м над ур.м; на склоне холма, густой вечнозеленый лес	листья	следы
Strobilanthes dalzielii (W.W. Sm.) Benoist (76)	По дороге из Центра Бонг на выходе из парка, 20º19′882"с.ш., 105º36′875" в.д., высота 288 м над ур.м	листья	0,003
		корни	0,003
Strobilanthes lilacinus C.B.Clarke (25)	Центр Бонг, зона В, слева от экологической тропы на север к достопримечательности парка «Большое дерево», 20º21′443" с.ш., 105º34′297" в.д., высота 338 м над ур.м	листья	0,004
Сем. Amaranthaceae
Amaranthus lividus L. (58)	Центральный въезд в Национальный парк, газон справа от въезда	биомасса	0
Achyranthes bidentata Blume (48)	По тропе из Центра Бонг в управление, за беседкой налево в сторону моста, край густого вечнозеленого леса	соцветия	0,17
		листья	0,01
Achyranthes bidentata Blume (72)	Центр Бонг, зона В, обочина тропы на краю густого вечнозеленого леса, 20º20′910" с.ш., 105º35′688" в.д., высота 370 м над ур.м	листья	0,02
		стебли	0,05
		корни	0,03
		соцветия	0,07
Cyathula prostrata (L.) Blume (1)	Центр Бонг, зона B, 20 км западнее от Главного управления парка, 20º21′002"с.ш., 105º35′609" в.д., высота 350 м над ур.м, открытое место при слиянии первичного и вторичного леса на месте поселения народа мынг	листья	0,11
		стебли	0,06
		корни	0,36
Cyathula prostrata (L.) Blume (49)	По тропе из Центра Бонг в управление, за беседкой налево в сторону моста, край густого вечнозеленого леса	соцветия	0,40
Сем. Anacardiaceae
Dracontomelon duperreanum Pierre (13)	Центр Бонг, зона A, слева у обочины дороги, одиночное крупное дерево	кора	0,22
Сем. Aquifoliaceae
Ilex rhotunda Thunb. (9)	Центр Бонг, зона B, 20 км западнее от Главного управления парка, на месте поселения народа мынг, одиночное культивируемое дерево	листья	0,06
Ilex purpurea Hassk. (23)	Центр Бонг, зона В, экологическая тропа на север к достопримечательности парка «Большое дерево», 20º21′375" с.ш., 105º34′932" в.д., высота 334 м над ур.м , понижение на выходе известняка	листья	0,004
Ilex cinerea Merr. (39)	По дороге из Центра Бонг, 150 м на север, не доезжая до станции лесников N 9	листья	0,10
Сем. Araceae
Arisaema balansae Engl. (11)	Центр Бонг, в начале экологической тропы к достопримечательности парка «1000-летнее дерево», под пологом вечнозеленого леса	листья	0
Alocasia cf.macrorrhiza (L.) Schott (22)	Центр Бонг, зона В, понижения вдоль обочин экологической тропы на север к достопримечательности парка «Большое дерево».	листья	0
Aglaonema modestum Schott ex Engl. (24)	Центр Бонг, зона В, экологическая тропа на север к достопримечательности парка «Большое дерево», обочина тропы справа	листья	0
Сем. Araliaceae
Schefflera octophylla Harms (50)	Дорога в Центр Бонг, 3 км направо от дороги вниз по склону возвышенности 20º16′180" с.ш., 105º41′467" в.д., высота 171 м над ур.м, вечнозеленый лес	листья	0
Сем. Capparaceae
Crateva nurvala Buch.-Ham. (52)	Центр Бонг, зона A, тропа направо вглубь леса от беседки, 20º17′595" с.ш., 105º40′082" в.д., высота 211 м над ур.м, неглубокий овраг под мостом	листья	0,01
		кора	0

Окончание табл.

Вид (номер образца)	Место сбора; экологические условия	Часть растения	Содержание 20Е, %
Сем. Convulvulaceae
Ipomoea sp . (57)	Центральный въезд в Национальный парк, слева на газоне	листья	0,01
Ipomoea sp. (31)	Центр Бонг, экологическая тропа, 20º21′019" с.ш., 105º35′582" в.д., высота 351 м над ур.м, слева от тропы на выходе из леса вблизи озера	надземная часть	0,02
Ipomoea congesta R. Br. (77)	Провинция Linh Đàm	листья	0,006
Сем. Dioscoreaceae
Dioscorea persimilis Prain & Burkill (35)	Центр Бонг, зона В, 20º20′941" с.ш., 105º35′682" в.д., высота 325 м над ур.м, обочина дороги	надземная часть	0,01
		корни	0,004
Сем. Malvaceae
Sida acuta Burm.f. (70)	Центр Бонг, зона В, 20º20′902" с.ш., 105º35′983" в.д., высота 362 м над ур.м, луг	листья	0,55
		корни	0,13
Sida rhombifolia L. (60)	На входе в Ботанический сад Национального парка, c левой стороны входа	листья	0,17
		корни	0,08
Urena lobata L. (62)	Главная аллея Ботанического сада, справа	листья	0
Сем. Myrsinaceae
Ardisia corymbifera Mez (7)	Центр Бонг, в начале экологической тропы к достопримечательности парка «1000-летнее дерево», под пологом вечнозеленого леса	листья	0
Ardisia crispa (Thunb.) A.DC. (17)	Дорога в Центр Бонг, 20º20′626" с.ш., 105º36′283" в.д., высота 300 м над ур.м, под пологом вечнозеленого леса	листья	0
Сем. Oxalidaceae
Averrhoa carambola L. (27)	Центр Бонг, зона В, экологическая тропа на север к достопримечательности парка «Большое дерево», рядом с банановой рощей 20º21′259" с.ш., 105º35′115" в.д., высота 343 м над ур.м	листья	0,004
Oxalis corymbosa DC. (30)	Центр Бонг, зона В, экологическая тропа на север к Большому дереву, 20º21′119" с.ш., 105º35′407", в.д., высота 351 м над ур.м	биомасса	0,06
Сем. Poaceae
Coix lacryma-jobi L. (54)	Вдоль дороги в Центр Бонг, на правой обочине	надземная часть	0
Сем. Rutaceae
Zanthoxylum avicennae (Lam.) DC. (63)	Культивируемое дерево вдоль главной аллеи Ботанического сада, справа, в глубине насаждений, 20º14′899" с.ш., 105º42′575" в.д., высота 184 м над ур.м	листья	0,002
		соцветия	0,007
		кора	0,04
Zanthoxylum scabrum Guillaum (43)	Там же, правая обочина дороги, 20º16′541" с.ш., 105º40′863" в.д., высота 253 м над ур.м	листья	0,02
Сем. Verbenaceae
Vitex leptobotrys Hallierf. (8)	Центр Бонг, в начале экологической тропы к достопримечательности парка «1000-летнее дерево» в глубине вечнозеленого леса	побеги	0,17
		листья	0,13
Vitex stylosa Dop (47)	Справа от дороги между станцией N 9 и Управлением, 20º15′126" с.ш., 105º42′773" в.д., высота 146 м над ур.м	листья	0,15
Vitex quinata (Lour.) F.N.Williams (51)	Дорога в Центр Бонг, беседка, направо вглубь леса, 20º17′574" с.ш., 105º40′041" в.д., высота 220 м над ур.м , густой вечнозеленый лес	листья	0,20
		кора	2,68
		листья	0,33
Callicarpa sp. (37)	Центр Бонг, зона В, правая обочина леса, в начале кругового движения 20º20′975" с.ш., 105º35′660" в.д., высота 325 м над ур.м	листья	0
Clerodendrum canescens Wall. ex Walp. (75)	Центр Бонг, на выходе из Национального парка, правая обочина дороги, 20º19′882" с.ш., 105º36′875" в.д., высота 288 м над ур.м	листья	0

Растение Achyranthes bidentata завезено во Вьетнам из Китая. В народной медицине Вьетнама его используют для лечения желтухи, малярии и гастрита. Лекарственные формы из растения назначают при артритах, гипертонической болезни, атеросклерозе, мочекаменной болезни, гематурии, аменорее, воспалении слюнных желез, ларингитах. Этот вид растений обладает противовоспалительным эффектом, снижает холестерин, используется при ревматизме, гипертонии, трудных родах, кровотечениях после родов, травмах и ангине. Растение традиционно используется в качестве иммуномодулятора, восстановителя сил и афродизиака.

Во Вьетнаме растение Cyathula prostrata используют так же, как корни Achyranthes bidentata . Настаивают на спирте для лечения артрита, а водную настойку применяют для лечения ревматизма. В Камбодже корни в сочетании с другими травами используют от заболеваний печени, при лихорадке и дизентерии. В медицине народности мынг, населявшей ранее территорию тропического леса, которая в настоящее время находится в пределах Национального парка Кук Фыонг, упоминаются следующие рода растений, в представителях которых мы обнаружили экдистероиды: Zantoxylum, Achy-ranthes, Sida, Vitex, Ilex [9].

В последнее время достигнуты большие успехи в развитии микронутриентологии. В частности, показано, что в рационе современного человека должно присутствовать не только сбалансированное количество известных макронутриентов (белков, жиров и углеводов), но и так называемых микронутриентов или минорных компонентов, поступающих человеку с растительной пищей. Для получения обогащенных микронутриентами функциональных продуктов питания в последние годы не рекомендовано использование растений, содержащих биологически активные вещества в больших концентрациях и относящихся к списку лекарственных. В этих целях могут быть использованы растения, содержащие невысокие концентрации действующих веществ и, что особенно важно, имеющие пищевое значение для человека в прошлом или в наши дни. Однако, примеров известных видов пищевых растений, содержащих фитоэкдистероиды, мало. К ним относятся, например, шпинат ( Spinacia oleracea L.) и квиноа ( Chenopodium quinoa Willd.). Оба вида из семейства Chenopodiaceae. Интересно отметить, что среди растений Национального парка Кук Фыонг, в которых мы обнаружили экдистероиды, оказалась группы видов растений, имеющих во Вьетнаме и других странах Юго-Восточной Азии пищевое значение.

Dracontomelon duperreanum – деревья высотой более 20 м, плоды которого употребляют в пищу в Камбодже, Вьетнаме и Китае. Во Вьетнаме дерево называется cây sấu, а плоды – quả sấu. Во вьетнамской кухне плоды используются в квашенном виде, похожем на японское блюдо «умебоши» (солено-квашеные плоды абрикоса). Засахаренные плоды являются лакомством для детей. Можно видеть, как на улицах Ханоя собирают и тут же продают эти плоды [10]. В будущих исследованиях сле- дует изучить на содержание экдистероидов другие виды из «положительной» трибы Spondieae семейства Anacardiaceae, произрастающие на территории Вьетнама и имеющие лекарственное и пищевое значение. Известно, что из листьев растений рода Ilex люди с древних времен готовят тонизирующие напитки. В Южной Америке из сушеных листьев падуба парагвайского I. paraguariensis готовят напиток мате. Имеются сведения об использовании листьев Ilex purpurea для приготовления чая во Вьетнаме. Поскольку содержание экдисте-роидов в изученных нами образцах невысокое, в будущих исследованиях следует установить вклад экдистероидов в тонизирующее и антиоксидантное действие суммарных экстрактов листьев падуба пурпурного.

Выводы

Таким образом, в выборочных трибах и семействах покрытосеменных растений во флоре Национального парка Кук Фыонг (Северный Вьетнам) проведен направленный скрининг на содержание экдистероидов. Всего выявлено 23 экдисте-роидсодержащих вида. Среди них виды, имеющие лекарственное и пищевое значение в традиционной медицине и кухне Вьетнама. В дальнейшем следует на принципах хемосистематики и молекулярной филогенетики с привлечением данных этно-ботанических исследований продолжить поиск экдисте-роидов в растениях флор Центрального и Южного Вьетнама.

Авторы благодарят сотрудников Национального парка Кук Фыонг за неоценимую помощь в проведении исследований на территории парка.

Исследования выполнены при финансовой поддержке Комплексной программы президиума УрО РАН по теме: «Получение клеточных культур экдистероидсодержащих растений рода Vitex (Verbenaceae) и научные основы их биотехнологического использования» (УрО РАН № 18-4-4-40) и Плана научно-исследовательских работ Российско-Вьетнамского тропического научно-исследовательского и технологического центра на 2018 г. по теме: «Биологически активные вещества тропических растений и микроорганизмов» (Эколан М-4.1).