Экофизиологические особенности коллекционных культур термофильных бактерий

Аэробные термофильные алкалотолерантные и алкалофильные бактерии, выделенные из щелочных гидротерм, описаны как представители рода Bacillus (B. pallidus, B. thermocloaceae, B. thermoaerophilus), рода Meiothermus (M. chliaro-philus, M. rosaceus, M. silvanus), Geobacillus cal-dotenax, рода Thermus (T. antranikianus, T. ig-niterrae, T. oshimai, T. thermophilus), Sphaerobac-ter thermophilus, Thermoaerobacter subterraneus, Thermomicrobium roseum, Isosphaera pallida, Rubrobacter xylanophilus [2, 3, 7, 8]. Оптимальная температура роста для термофилов составляет 50-750С, а для экстремально-термофильных и гипертермофильных бактерий и архей оптимальная температура роста находится в диапазоне 75-1050С, максимальная температура достигает значений 1000С и выше [8]. Хотя большинство микроорганизмов развивается в сравнительно небольшом температурном диапазоне, разница между минимальной и максимальной температурами составляет 20-350С, описаны бактерии с разницей предельных температур более 350С. Значительный интерес к экстремо-филам обусловлен их способностью развиваться в пограничных условиях существования жизни и высоким биотехнологическим потенциалом ферментных систем, устойчивых к действию высоких температур и рН.

Материалы и методы исследования

В работе были использованы коллекционные культуры термофильных аэробных органотроф-ных микроорганизмов, выделенных из проб горячих источников Бурятии и Монголии.

Культивирование проводили на жидкой модифицированной среде Пфеннига при температурах 30, 35, 40, 45, 50, 60 и 70 0С. Рост культур оценивали по изменению оптической плотности при 600 нм. Удельную скорость роста бактериальных культур рассчитывали по формуле:

ln X - ln X

µ=         0

t - t ₀

, где X и X0 – значения оптической плотности культуры в моменты времени t и t0.

Для оценки оптимальных и максималь-но/минимально возможных температур роста культур термофильных органотрофных бактерий экспериментальные данные аппроксимировали в соответствии с моделью Россо [6], кото- рая связывает оптимальную удельную скорость роста µopt при температуре Topt, а также минимальную, оптимальную и максимальную температуры (Tmin, Topt, Tmax) с максимальной удельной скоростью роста µmax при температуре Т:

τ=

( T где ^opt

0, Т<Т min µ max (T) = µ opt τ(T), T min max , 0, T>T max

² max min

- T _min)[( T_opt - T _min)( T - T_opt ) - ( T_opt -

T max )( T opt + T min - 2 T )]

.

Для вычисления T min , T opt и T max использовался метод наименьших квадратов, при этом минимизировали сумму квадратов отклонений

Q min . Для оценки точности аппроксимации вычисляли стандартное квадратичное отклонение σ, выраженное в процентах:

Qmin n-p σ= n p 100%

^µ opt

, где n – количество экспериментальных точек, p – количество параметров.

Результаты и обсуждение

Исследованные культуры микроорганизмов изолированы из гидротерм с различным температурным режимом и различной – слабощелочной до сильно-щелочной – реакцией среды. Морфологически клетки бактерий представляли собой разные спорообразующие граммпо-ложительные палочки, размеры которых варьировали в пределах от 0,9-2,3 до 1,9-8,4 мкм. На питательном агаре бактерии образовывали колонии кремового цвета. Наиболее активный рост культур был отмечен при рН 8,0-8,5; диапазон pH составлял от 6,0 до 9,5, что позволило отнести их к группе алкалотолерантных организмов. По культуральным признакам, морфофизиологическим и биохимическим свойствам все исследованные культуры были близки к представителям родов Bacillus и Anoxybacillus [3, 11]. Анализ гена 16S рРНК штаммов Al-9-1, Se-1, Ga-1-1 и Ga-9-2 показал, что они являются представителями рода Anoxybacillus . Ближайшими гомологами штаммов Al-9-1, Se-1, Ga-1-1 является Anoxybacillus pushchinoensis AT-2 (AB234214), штамма Ga-9-2 – A. flavithermus DSM 2641 ( Z26932), однако сходство между ними не превышает 95-96%.

Анализ гена 16S рРНК штаммов Ur-6, Br-2-2 и А2 показал, что они относятся к представителям рода Bacillus. Наибольшее сходство у культуры Ur-6 выявлено с Bacillus hemicellulosolyti- cum C-11 (99%). Штаммы Br-2-2 и А2 на 97 и 99% соответственно близки к B. licheniformis BBDC6. Все исследованные термофильные культуры из щелочных гидротерм Бурятии (Гар-га, Гусиха, Алла, Уро, Сея, Большая Речка) развивались при температурах от 30 до 70 0С. Для культур Ga-1-1 и Gu-1 оптимальная температура роста составляла 45 и 49 0С, соответственно максимальной температурой роста для этих культур была температура 67 0С. Для культур Ga-6 и Gu-2 оптимум температуры составил 60 0С, для Ga-9-2 – оптимальная температура роста 57 0С, диапазон развития 37-75 0С.

Для штаммов, выделенных из Аллинских источников, диапазон роста определен в пределах 35-67 0С. Оптимальная температура роста для культур A2, А3, А4, А5 и Al-9-1 равна 49-500, а для культуры А1 оптимум температуры составил 450С.

Все культуры, выделенные из Уринского и Большереченского источников, являются умеренными термофилами с диапазоном развития 35-70 0С и оптимумом развития при 45-50 0С. Несмотря на наличие общих черт, температурные характеристики Сеюйских штаммов имеют ряд отличий. Культуры Se-3, Se-4 и Se-6-2 имеют оптимум роста 50-52 0С, Se-5 имеeт оптимум роста при 45 0С, Se-1 – при 49 0С.

Диапазон роста всех штаммов из низкоминерализованных щелочных гидротерм Монголии

(Хужирт, Шиверт и Цэнхэр) варьировал от 37 до 750С. Ниже 370С и выше 750С рост культур не наблюдался. Оптимум развития штаммов был от 58 до 610С.

Экспериментально температурный диапазон развития бактерий был от 30-35 до 70-75 0С, с оптимумом от 45 до 610С. Термофильные бациллы, составляющие "группу 5" по классификации Эша с соавторами [1], характеризуются более высокими температурными характеристиками: минимум – 35-48 0С, максимум – 65-78 0С, оптимум – 55-65 0С.

Визуальный анализ кривых роста свидетельствует, что культуры различаются по температурам роста и могут быть разделены на несколько групп. В первую группу можно отнести штаммы, выделенные из Сеюйского, Аллинско-го, Уринского и Большереченского источников, которые характеризуются сходными значениями минимальных и максимальных температур, отсутствием выраженных пиков роста и наличием плато в области температур 40-600С. Иначе ведут себя культуры Ga-1-1, Ga-9-2 и Gu-2, у которых наблюдался пик роста, соответствующий оптимальным температурам 45 0С (для Ga-1-1) и 60 0С (для Ga-9-2 и Gu-2). В эту же группу входят культуры, выделенные из гидротерм Монголии: Т4, S4 и H5, на их кривых роста также отмечается выраженный оптимум при 60 0С. Нас интересовало, как ведут себя культуры при более высоких температурах: 70 0С и выше.

Для оценки влияния температуры на рост бактерий сравнивали средние удельные скорости роста культур (µср), рассчитанные на отрезках экспоненциальных фаз роста культур при всех исследованных температурах. Однако, учитывая, что подобный подход не гарантирует из- бежания субъективных ошибок, а значения µср не могут быть использованы в расчетах оптимальных удельных скоростей роста (µopt), мы попытались апробировать полученные экспериментальные данные на существующих математических моделях зависимости роста микроорганизмов от температуры. Модели микробного роста обычно описывают изменения максимальной удельной скорости роста, которая отображает метаболическую активность конкретного микроорганизма в данных условиях среды. Существует несколько моделей для описания эффекта температуры на максимальную удельную скорость роста (µmax) [5, 6, 9].

Модель Ратковского [5], записанная в виде F(x) = f(x)e^{g(x )} , служит основой для большинства моделей, описывающих зависимости удельных скоростей роста бактерий от температуры и рН. При этом возможны корреляции между параметрами и возрастает вероятность ошибки. Кроме того, некоторые параметры не имеют ясного биологического значения, что затрудняет их вычисление.

Модель Вицеса [9] описывает рост микроорганизмов при температурах, близких к оптимальным, и во всем диапазоне значений рН, при которых наблюдается рост:

µ max = b 1 {(pH – pH min )[1 – e^{C1(pH – pHmax)}](T – T min )}², где рН max и pH min – значения рН, при которых рост микроорганизмов уже не наблюдался, Т (⁰С) – исследуемое значение температуры, T min – нижняя граница роста организма, b 1 (час^{-1 0}С^-2) и с 1 – коэффициенты регрессии.

Звитеринг с соавторами [10] предложил другую модель для всего диапазона значений температуры и рН, при которых наблюдается рост:

µ max = µ opt γ (pH) γ (T),

. H ) = [ ( pH - pH min)[1 - eC ^{2( pH} — ^pH max)] V

^Y p     | ( pHopt - pH min)[1 - eC ^{2( pHop}‘ - ^{pH max)}] I

γ ( T ) =

' ( T - T min )[1 - e C ^{3( T - T} ma^x) ] V (T opt - T min )[1 - e C ^{3( Topt - T} max) ] J

В данной модели используется девять параметров: pH opt и T opt , при которых значение µ max наибольшее; pH min , pH max , T min , T max – предельные значения рН и температуры для роста микроорганизма; µ opt - µ max при оптимальных значениях температуры и рН; С2 и С3 – коэффициенты регрессии.

В нашем случае наиболее удобной оказалась модель Россо, так как ее параметры не имеют значительных структурных корреляций, а зна- чения Tmin, Topt и Tmax можно оценить исходя из реально возможных свойств микроорганизмов. Модель Россо описывает характерный ход кривой µ(Т) с оптимумом, сдвинутым в сторону максимальной температуры, при которой рост еще возможен. По результатам экстраполяции исследованные термофильные микроорганизмы можно разделить на две группы – с оптимумом температур в пределах 50-53 и 62 0С (табл. 1).

В группе 1 можно дополнительно выделить культуру Ga-1-1, которая отличается более низкими температурными характеристиками роста.

В целом построенная аппроксимация хорошо описывает экспериментальные данные. По результатам расчетов максимальные температуры роста культур на 5-100С превышали данные экс- перимента. Косвенно подтверждают эти расчеты данные по температурным оптимумам протеазных ферментов, выделенных из исследуемых культур. По данным Бабасановой [11], выделенные ферменты сохраняли до 45% активности при температурах до 75 0С, с оптимумом около 65 0С.

Таблица 1

Рассчитанные температурные параметры роста коллекционных культур микроорганизмов

3 в	О	О	40 Я О	9 о	СЧ О		СЧ <	<	<	<	os	5	5	40 5	ГМ S	Г1! S	СЛ	ей	ей	ей	40 е/)	40 е/)	н		к
Т	2	3	3	3	3	3	3	3	3	3	3	3	3	3	3	3	3	3	3	3	3	3	3	3	3
n	5	4	4	1	5	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	5	5	5
Т opt	5	6	6	5	6	5	5	5	5	5	5	5	5	5	5	5	5	5	5	5	5	5	6	6	6
	0	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	3	3	3	0	0	0
Т	7	8	8	7	8	7	7	7	7	7	7	7	7	7	7	7	7	7	7	7	7	7	8	8	8
x	0	5	5	4	5	4	4	4	4	4	4	4	4	4	4	4	4	4	4	4	4	4	5	5	5
σ,	1	1	1	1	1	1	2	2	1	1	2	2	1	1	1	1	2	2	1	1	1	1	1	1	2
%	4,	7,	5,	6,	2,	8,	4,	4,	8,	8,	2,	1,	9,	9,	9,	9,	3,	0,	9,	7,	9,	9,	7,	6,	0,
	0	5	4	2	8	0	4	3	3	3	1	5	5	8	4	0	9	5	7	8	5	5	5	4	0

Все полученные аппроксимации симметричны относительно оптимальной температуры, в то время как модель Россо предсказывает асимметричную кривую с более крутым спадом в районе максимальных температур. Подобные симметричные кривые были получены ранее при расчете температурных характеристик для аэробных культур алкалотермофильных бактерий из гидротерм Бурятии [12]. По-видимому, такое поведение является характерным для термофильных органотрофных бактерий, способных развиваться в достаточно широком температурном диапазоне. Анализ зависимости максимальных удельных скоростей роста от температуры у культур, выделенных из источников Сеюйский, Уринский, Большереченский и Ал-линский, показывает наличие плато в области температур 40-60 0С, что является характерной чертой видов, толерантных по отношению к температуре.