Экотоксикологическая оценка поверхностных вод с территории хранилища радиоактивных отходов (пос. Водный, Республика Коми) с использованием ряски малой (Lemna minor L.)

Нерациональное использование природных ресурсов приводит к серьезным экологическим проблемам. Одна из них – это загрязнение пресноводных водоемов. На территории Республики Коми в пос. Водный с 40-х гг. прошлого столетия находится хранилище радиоактивных отходов. Здесь располагалось производство по добыче радия из пластовых вод и отходов урановой промышленности. Отходы складировались на берегу р. Ухта. В 1960 г. активность воды в ручьях, стекающих с хвостохранили-ща, достигала 111 Бк/кг, отчего содержание радия в р. Ухта местами увеличивалось до 2,85 Бк/кг. Данная величина в пять–семь раз превышает действующие в настоящее время нормативы содержания 226Ra в питьевой воде (по НРБ-99 – до 0,5 Бк/л) [1]. Со временем произошло снижение выноса радия с хранилища, обусловленное вымыванием растворимых соединений и переходом оставшихся радионуклидов в нерастворимую фазу [2].

Помимо радиационного фактора серьезную опасность представляло химическое загрязнение воды и почвы на территории хранилища радиоактивных отходов. Главным образом, оно было связано с присутствием высоких концентраций бария и хлора. Хлорид бария использовался в технологическом процессе при функционировании производства. В данной работе проведена оценка токсичности природных вод на территории хранилища радиоактивных отходов пос. Водный Республики Коми с использованием в качестве тест-объекта лабораторной культуры ряски малой (Lemna minor L.). Выполненное исследование представляет интерес не только с точки зрения решения задач мониторинга, но и реакции перспективного тест-организма – ряски малой на комплексное радиационное и химическое загрязнение. Ряска малая является типичным представителем флоры пресноводных водоемов. Рясковые считаются чрезвычайно ценным экспериментальным объектом для морфогенетических, физиологических и биохимических исследований бла- годаря неприхотливости к среде, малым размерам, быстрому росту, относительной простоте строения и преобладанию вегетативного размножения, что позволяет использовать всего один генетически однородный клон на протяжении всего эксперимента [3].

Материал и методы

Растительный материал. Использовали лабораторную культуру ряски малой Института биологии Коми НЦ УрО РАН. Культивирование ее проводили в климатической камере KBWF 240 (Binder, Германия) при стандартных условиях: температуре 24±0.1 °С, фотопериодичности 16 ч свет/8 ч темнота, 70 % влажности. Интенсивность света 8 тыс. люкс, представлена холодно-белым светом люминесцентных ламп.

Район исследования. Пробы воды взяты из водоема на территории хранилища радиоактивных отходов, расположенного на берегу р. Ухта в пос. Водный. В качестве положительного контроля использовалась вода из озера, которое находится на противоположном берегу реки. Забор проб происходил в июне 2014 г. В качестве отрицательного контроля использовали среду Штейнберга.

Вклад внешнего γ-излучения учитывали, измеряя мощность экспозиционной дозы с помощью дозиметра. Мощность такой дозы около водоема на территории хранилища радиоактивных отходов составляет 50 мкР/ч, экспозиционной дозы около озера – в пределах нормы (8–10 мкР/ч).

Радиохимический анализ воды и анализ ка-тионно-анионного состава. Радиохимический анализ воды проведен в лаборатории миграции радионуклидов Института биологии Коми НЦ УрО РАН (аттестат аккредитации № CAPK RU.0001.441623), катионно-анионный состав определили в лаборатории «Экоаналит» (Аттестат аккредитации РОСС RU.0001.511257) Института биологии Коми НЦ УрО РАН. По результатам химического анализа проведена оценка токсичности отдельных компонентов воды с территории хранилища радиоактивных отходов по изменению морфометрических характеристик лабораторной культуры ряски малой.

Оценка токсичности воды с хранилища РАО. При проведении эксперимента колонии, состоящие из двух–четырех фрондов, отбирали из материнской культуры и переносили в тестовые ёмкости с 100%-ной природной водой из водоема на территории хранилища и озера. Вода была предварительно отфильтрована. Каждая экспериментальная емкость содержала 9–12 пластинок. В качестве отрицательного контроля использовали питательную среду Штейнберга. Время экспозиции составило 28 дней. Проанализированы изменение удельной скорости роста (на 7, 14, 21 день), площади листовой поверхности (через семь дней), уровень и характер повреждения фрондов в виде хлорозов и некрозов (через 7,14, 21, 28 дней), изменение окраски фрондов. Средняя удельная скорость роста рассчитывается как логарифметическое увеличение темпа роста – количества фрондов для каждой параллели опытных и контрольных групп [4].

μ i-j = (ln (N j ) – ln (N i ))/t, где μ i-j – средняя удельная скорость роста от времени i до времени j, N j – переменная теста в опыте во время j, N i – переменная теста в контроле во время i, t – период времени от i до j.

Чтобы определить время удвоения (Td) числа фрондов для проверки на соответствие критерию достоверности (удвоение в контроле менее чем за 60 ч.), использовали следующую формулу: Td = ln2/μ.

Исследование выполнено на базе ЦКП «Молекулярная биология» ИБ Коми НЦ УрО РАН.

Расчет площади фронда проводили по фотографиям до воздействия и через семь дней после [4]. Изображения проанализированы с помощью программного обеспечения Image J ( NIH , USA).

Оценка токсичности отдельных компонентов воды . На основании анализа катионно-анион-ного состава воды были определены потенциально опасные для роста и развития ряски ионы, и в лабораторных условиях проведены эксперименты по оценке их влияния на морфометрические показатели и рост. В эксперименте применяли концентрации, сопоставимые с аналогичными на территории хранилища. В качестве источника ионов кальция использовали Ca(NO 3 ) 2 ·4H 2 O, ионов хлора – CaCl 2 , цинк-ионов – ZnSO 4 ·7H 2 O, ионов бария – Ba(NO 3 ) 2 , ионов стронция – Sr(NO 3 ) 2 , ионов калия – KNO 3 , KH 2 PO 4 , K 2 HPO 4 , ионов бора – H 3 BO 3 , ионов молибдена – Na 2 MoO 4 ·2 H 2 O. Концентрации цинка – 0; 0,63; 1,26; 3,15; 6,3; 12,6; 79 мкмоль/л. В качестве отрицательного контроля применялась среда Штейнберга. Кислотность среды оставалась стабильной при всех условиях теста. Тестирование на угнетение роста проводили в соответствии со стандартной методикой в течение семи дней [5]. Эксперименты проводили в трех повторностях.

Для количественной оценки результатов сочетанных воздействий использовали коэффициент взаимодействия (K w ), который определяется как отношение инкремента ответной реакции системы на совместное действие факторов к сумме инкрементов эффектов при их раздельном действии [6].

К w =ΔА(X; Y)/ ΔА(0; Y)+ ΔА(X; 0), где ΔА(X; Y)=ΔА(X; Y)- ΔА(0; 0) – инкремент (превышение индуцированного стрессорами X и Y уровня над спонтанным).

Статистическая обработка осуществлялась с помощью программного пакета Statistica 6.0. Достоверность различий между параметрами в опыте и контроле определяли по критерию Стъюдента, Манна-Уитни, одностороннего дисперсионного анализа.

Результаты и обсуждение

Активность воды из водоема на территории хранилища и озера соответствует нормам радиационной безопасности (НРБ): активность 228 Th до 0,4 мБк/л, 230 Th – до 5 мБк/л, 232 Th – до 0,2 мБк/л, 226 Ra – до 148 мБк/л. Результаты химического анализа воды представлены в таблице. Природная вода обо-

Сравнение содержания отдельных элементов в воде хранилища РАО и среде Штейнберга

Comparing the content of separate elements in the water of a radioactive waste storage and Steinberg medium

Показатель Среда Штейнберга, мг/л Хранилище РАО (мг/л) К 160 15±2,4 Са 50 150±24 B 0,02 0,276±0,06 Zn 0,041 От 0,0055 до 0,96(±0,19) Sr 0 3,2±0,5 Ba 0 0,3±0,5 Mo 0,017 0,004±0,0011 Mg 9 25 их участков имеет повышенное содержание гидрокарбонатов (400-420 мг/л), низкое содержание нитратов (до 0,044 мг/л), калия (5-15 мг/л), фосфатов (до 1 мг/л). Наличие слабоминерализованных вод, нехватка жизненно необходимых элементов снижают устойчивость организмов к воздействию токсикантов. В воде из водоемов хранилища по сравнению с озером имеется высокое содержание бария (0,3 мг/л), ПДК превышает в три раза, а также избыток хлора (160 мг/л). Хлорид бария использовался в технологическом процессе при функционировании производства. Цинк (от 0,0055 до 0,95 мг/л), стронций (3,3 мг/л) и молибден (0,017 мг/л) также присутствуют в водоеме на территории хранилища в высоких для ряски концентрациях. Накопление тяжелых металлов может привести к осмотическому, окислительному стрессу и снижению роста, появлению повреждений фрондов.

Удельная скорость роста ряски, выращенной на воде из водоема на территории хранилища РАО, через 7, 14, 21 день снизилась на 52,7; 58; 62,5 % соответственно по сравнению с отрицательным контролем (рис. 1). Скорость роста ряски в положительном контроле статистически достоверно ниже, чем в водоеме на территории хранилища РАО (р≤0,05).

Фронды ряски малой имеют интенсивно зеленую окраску. У ряски, выращенной на воде с территории хранилища, имеются растения светлозеленого цвета, а также желтые и буро-желтые. Уже на седьмой день эксперимента в опытных ёмкостях появились хлорозы и некрозы (рис.2). Хлорозы – пожелтение или полное обесцвечивание фронда в результате потери пигмента, некрозы – локализованные отмершие области ткани (коричневые или белые). Появление повреждений фронда в виде хлорозов и некрозов является показателем сильного токсического действия стрессирующих факторов. При прорастании ряски на питательной среде подобные морфологические изменения практически не встречаются (меньше 5%). Подсчет доли поврежденных фрондов при анализе воды с радиационно-загрязненных водоемов целесообразно производить на 21-, 28-й день [7]. Нарушение морфогенеза при облучении клеток зависит от степени зрелости зародышевых фрондов, поэтому радиочувствительность возрастает с номером дочернего фронда [8]. При прорастании ряски на воде с хранилища радиоактивных отходов доля поврежденных растений через 7, 14, 21, 28 дней составляет 16, 25, 37, 55 % (рис.2). У ряски, выращенной на воде из озера, доля растений с хлорозами и некрозами ниже, но незначительно.

Изменения площади фрондов ряски, выращенной на воде с хранилища, не произошло. По сравнению с контролем сократилась площадь фрондов ряски, выращенной на воде из озера (р≤0.05).

Слабая минерализованность природных вод – одна из причин угнетения роста ряски на природной воде, так как для гидрофитов химический состав водной среды является главенствующим экологическим фактором. В то же время в водоеме на территории хранилища РАО имеется повышенное со-

Рис. 1. Изменение удельной скорости роста ряски малой (Lemma minor L.). (* – скорость роста ряски в отрицательном контроле выше, чем на природной воде, t – критерий Стъюдента, р ≤ 0,01, ** – скорость роста ряски выше на воде из озера по сравнению с водой из хранилища РАО, критерий Стъю-дента, р ≤ 0,05).

Fig.1. The change of the specific growth rate of duckweed (Lemma minor L.). (*- growth rate of duckweed in the negative control is higher than in natural water, t – Student’s criterion, р ≤ 0,01, ** -growth rate of duckweed is higher in the lake water compared to water from radioactive waste storage, Student’s criterion, , р ≤ 0,05).

Рис. 2. Уровень поврежденных растений. * – отличия достоверны при р ≤ 0,05 по сравнению с отрицательным контролем, критерий Манна-Уитни.

Fig.2. The level of damaged plants. * – differences reliable at р ≤ 0,05 compared to negative control, Mann-Whitney criterion.

держание кальция, магния, что должно способствовать лучшему росту ряски на этой воде по сравнению с озером. Причиной замедления роста ряски на воде из хранилища РАО по сравнению со средой и появлению поврежденных растений может быть содержание тяжелых металлов в токсичных концентра-

циях (цинка, стронция, бария), а также хлора (до 160 мг/л). Для выяснения этого изучили влияние каждого компонента на лабораторную культуру ряски.

Повышенное по сравнению с контролем содержание кальция (в три раза), бора (в 10 раз), магния (в 2,8 раза), хлора (в три раза) не приводит к изменению удельной скорости роста, площади фронда и увеличению доли поврежденных растений (р≤0,01) (рисунки 3, 4). При избытке молибдена (в восемь раз) и недостатке калия (в 10 раз) уменьшается площадь фрондов (p≤0.05) (рис. 4).

Рис. 3. Изменение удельной скорости роста при воздействии на ряску макро- и микроэлементов в концентрациях, идентичных природной воде хранилища РАО (пос. Водный) (* – отличия достоверны по сравнению с контролем (среда Штейнберга), при р ≤ 0,05, t – критерий Стъюдента).

Fig.3. The change in specific growth rate at impact on duckweed of macro- and microelements in concentrations identical to that of natural water of radioactive waste storage (village Vodny) (* - differences are reliable compared with control (Steinberg medium), at р ≤ 0,05, t – Student’s criterion).

Рис. 4. Изменение площади фрондов (площадь через семь дней после начала воздействия, S1 – площадь до начала воздействия, * – отличия достоверны при р ≤ 0,05, t – критерий Стъюдента).

Fig.4. Changes of the area of fraunds (the area in 7 days after the beginning of impact, S1 – area before impact, * – differences reliable at р ≤ 0,05, t – Student’s criterion).

Цинк является необходимым для растений микроэлементом, играет важную роль в белковом, углеводном и фосфорном обмене, в биосинтезе витаминов и ауксинов, выступает в качестве кофак- тора или компонента нескольких ферментов, связанных с синтезом белков, а также нуклеиновых кислот и липидов, играет важную роль в поддержании целостности плазматических мембран, тем самым снижая окислительный стресс от присутствия токсикантов. В оптимальных количествах он повышает активность физиологических процессов в растениях и их продуктивность, при избытке – ингибирует их рост и развитие [9, 10]. Концентрация цинка в воде хранилища от 5 до 960 мкг/л (табл.). Однофакторный дисперсионный анализ данных показал, что имеется прямая зависимость между концентрацией цинка в растворе и удельной скоростью роста (F=127, p≤0.01) (рис. 5). Концентрация цинка в воде хранилища приводит к сокращению удельной скорости роста, увеличению доли поврежденных растений (р≤0,01), а также изменению окраски фрон-дов на желто-зеленую. Уменьшение площади фрон-дов происходит при концентрации цинка от 3,15 мкмоль/л (рис.5).

Рис. 5. Изменения удельной скорости роста ряски малой в зависимости от концентрации цинка (* – достоверно по сравнению с контролем, р ≤ 0,05, t – критерий Стъюдента).

Fig.5. Changes of specific growth rate of duckweed depending on the concentration of zinc (* - reliable compared to control), р ≤ 0,05, t – Student’s criterion).

Барий. При функционировании производства по обогащению радия в технологическом процессе использовался хлорид бария, поэтому избыток бария и хлора в воде на территории хранилища радиоактивных отходов имеет техногенное происхождение. Содержание бария в воде превышает в три раза ПДК и составляет 0,3 мг/л. Барий – элемент довольно значительной аккумуляции в растениях, его биологическая роль изучена слабо. У животных избыток бария вызывает баритоз. Ион бария, имея близкий радиус с ионом калия, конкурирует с ним, вследствие чего наступает гипокалиемия [11, 12]. В эксперименте на угнетение роста ряски протестированы два варианта: с избытком бария (В1) и с избытком бария и низким содержанием калия (как в воде хранилища) (В2). Оба варианта приводят к значимому сокращению скорости роста ряски малой (р≤0,01) (рис.3). Удельная скорость роста ниже при недостатке калия (В2) и избытке бария по сравнению с воздействием В1 (р≤0,01). Коэффициент взаимодействия при совместном действии бария и недостатка калия составляет 2,3, т.е. при недостатке калия повышается чувствительность растений к действию бария. Увеличение доли поврежденных растений наблюдается при воздействии бария и недостатке калия (р≤0,01). При воздействии данной концентрации бария не происходит изменения площади фрондов, но совместно с недостатком калия площадь поверхности фрондов уменьшается (p≤0.01, критерий Манна-Уитни) (рис.4).

Стронций. В воде на территории хранилища высокое содержание стронция (0,5 ПДК, 3,3 мг/л). Стронций в данной концентрации приводит к снижению удельной скорости роста по сравнению с контролем (р≤0,01) (рис.3). Доля поврежденных растений и площадь фрондов остаются на уровне контрольных (р≤0,01).

Таким образом, снижение удельной скорости роста ряски малой на воде из хранилища радиоактивных отходов происходит за счет избытка цинка, бария, стронция. Для выяснения синергизма-антагонизма факторов в сокращение удельной скорости роста использовали коэффициенты взаимодействия. Анализ полученных данных с помощью коэффициента взаимодействия показал, что если только рассматриваемые элементы являются причиной замедления темпа роста, то наблюдается аддитивное сложение вклада каждого фактора (Квз=1). Доля растений с некрозами и хлорозами увеличивается при недостатке калия, недостатке калия совместно с избытком бария и при воздействии цинка с концентрацией от 6,3 мкмоль/л. Площадь фрондов уменьшается при воздействии сочетания избытка бария и недостатка калия, недостатке калия, избытке молибдена.

Заключение

Активность образцов воды, взятой с хранилища РАО и озера, расположенного на противоположном берегу, соответствует нормам радиационной безопасности. Несмотря на это, для ряски малой вода из водоема хранилища является токсичной, вызывает 50 % сокращение удельной скорости роста, высокий уровень хлорозов и некрозов. Причинами являются недостаток калия, повышенное содержание отдельных тяжелых металлов (стронция, цинка) в водах данного региона, а также химическое загрязнение воды на территории хранилища барием.

Работа выполнена при финансовой поддержке ФАНО (№115012860038) и проекта комплексной программы УрО РАН 15-2-4-26 (№115082510016).