Экспериментальная модель тендинопатии пяточного сухожилия на фоне локального введения аутологичной обогащенной тромбоцитами плазмы

Современные теории возникновения тен-динопатий ставят под сомнение традиционное объяснение этиологических факторов и патофизиологических механизмов только с позиций воспалительного процесса и приписывают им более сложный уровень взаимодействия [11, 13].

Этиология тендинопатий остается не совсем понятной, а большинство известных причин, таких как гипоксия, гипертермия, апоптоз, воздействие медиаторов воспаления, молочной кислоты («окислительный стресс»), дисбаланс матричных металлопротеиназ и других остаются предметом теоретических рассуждений [2, 11, 13, 16].

Имеющиеся данные морфологических исследований свидетельствуют о преобладании при тендинопатиях дегенеративных изменений в ткани сухожилий над воспалительными. Причем последние прослеживаются в основном в тех случаях, когда сухожилия окружены и тес- но взаимодействуют с синовиальной тканью паратенона или слизистой сумки [8, 10, 13].

В основе традиционного лечения тендино-патий лежит назначение противовоспалительных препаратов, которые, очевидно, не решают проблемы изменений структуры и репаративного процесса, маскируя их хронизацию и прогрессирование [7].

Как показывает клиническая практика, применение ортобиологических методов лечения и, в частности, локальное инъекционное введение аутологичной обогащенной тромбоцитами плазмы при отдельных нозологических формах тендинопатий и паратендинопатий показало обнадеживающие результаты. Однако патогенетические механизмы происходящих при этом процессе, морфогенез тканей сухожилий на фоне введения ОТП изучены еще не достаточно [1, 3, 6, 12, 15].

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Получение новых данных о влиянии аутологичной обогащенной тромбоцитами плазмы на морфогенез ткани сухожилия в условиях экспериментальной модели тендинопатии.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Проведенное исследование носило экспериментальный характер и предполагало работу с лабораторными животными. При этом были соблюдены все требования, изложенные в правилах лабораторной практики (GLP), «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985) и приказе МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 «Об утверждении правил лабораторной практики».

В исследование было включено 20 половозрелых крыс линии Wistar весом 250–350 г. Все манипуляции с животными проводили под общим обезболиванием с использованием препарата «Рометар» (Bioveta, Чешская республика) по методике, описанной производителем.

Лабораторные животные были распределены на 5 групп (G1-G5) по 4 крысы в каждой. Первая группа (G1) являлась контрольной и оставалась интактной на протяжении всего исследования. Во всех остальных группах (G2– G5) осуществляли моделирование тендинопа-тии пяточного сухожилия путём внутри- и око-лосухожильного введения 0,5 мл 10%-й суспензии стерильного талька в течение 6 недель по 2 инъекции в неделю (см. табл.).

Характеристика экспериментальных групп животных

Порода животных		Крысы линии Wistar
Возраст		Половозрелые
Масса		265 ± 2,2 г
Вводимый препарат Группы	10%-я суспензия стерильного талька, 0,5 мл	0,9%-й раствор NaCl, 0,2 мл	ОТП, 0,2 мл	Гиалуроновая кислота, 0,2 мл	ОТП + гиалуроновая кислота, 0,2 мл
Контрольная (G1)	-
Экспериментальная (G2)	+	+
Экспериментальная (G3)	+		+
Экспериментальная (G4)	+			+
Экспериментальная (G5)	+				+
Сроки выведения животных из эксперимента	-	10 недель	10 недель	10 недель	10 недель

После формирования патологического процесса у животных экспериментальных групп с лечебной целью проводили введение 0,2 мл сравниваемых препаратов в область пораженного сухожилия. В группе G2 вводили физиологический раствор NaCl, в G3 – аутологичную обогащенную тромбоцитами плазму (ОТП), в G4 – препарат гиалуроновой кислоты (ГК) «Русвиск» (Русвиск, Россия) с молекулярным весом 3–3,5 × 106 Да, в G5 – комбинацию ОТП и ГК. В каждой группе было выполнено 3 инъекции с интервалом в 1 неделю, а в группе G5 – 2 инъекции ОТП и 1 инъекция ГК. Все вышеуказанные препараты, равно как и суспензию стерильного талька во время моделирования патологического процесса, вводили в область пяточного сухожилия на 0,5 см от места его прикрепления к кости (рис. 1).

а                                б

Рис. 1. Моделирование тендинопатии: получение аутологичной ОТП (а) и введение её в область пяточного сухожилия (б)

Для получения ОТП забирали 1,2 мл цельной крови из бедренной вены животных в шприц с предварительно набранными 0,4 мл 5%-го раствора цитрата натрия. Полученную кровь сливали в герметично закрывающуюся стерильную стеклянную полупрозрачную емкость и помещали в центрифугу «RotoFix 32А» (Hettich, Германия) с соответствующим противовесом. Первое центрифугирование проводили в течение 5 минут со скоростью 1 500 об./мин. Затем забирали 0,8 мл надосадочной жидкости, которую помещали в другую аналогичную стерильную емкость и выполняли второе центрифугирование со скоростью 1 000 об./мин в течение 5 минут. Затем удаляли 0,6 мл надосадочной жидкости, а оставшуюся в пробирке ОТП объемом 0,2 мл несколько раз встряхивали и забирали с помощью шприца.

В ходе наблюдения за животными экспериментальных групп в процессе формирования модели тендинопатии, последующего лечения отмечали изменения общего состояния, локальные изменения в области инъекций и степень участия вовлеченной конечности в нагрузке и движениях.

Через неделю с момента последней лечебной инъекции в G3–G5-группах, через 4 недели после завершения моделирования тендинопатии в G2-группе и спустя 10 недель с момента начала эксперимента в G1-группе, животных выводили из исследования, введением летальной дозы препарата «Рометар». Таким образом, завершающим сроком эксперимента во всех группах животных явились 10 недель. Для гистологического анализа вычленяли костно-сухожильно-мышечные блоки, которые фиксировали в 10%-м нейтральном растворе забуференного формалина. Далее ткани, проведенные по батареи спиртов возрастающей концентрации, заливали в парафин. После чего изготавливали срезы толщиной 5–6 мкм и окрашивали их гематоксилином и эозином, толуидиновым синим по Масону.

Световую микроскопию выполняли на микроскопе «MICROS» (Австрия) при увеличении ×100 и ×400 с последующим фотографированием фотокамерой «OLYMPUS» (Япония).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Основное заключение, состояло в том, что ОТП, введенная в область пяточного сухожилия в условиях экспериментальной модели тендинопа-тии, обладает противовоспалительным эффектом, способствуя сохранению и, возможно, восстановлению его нарушенной структуры. Спустя 10 недель после начала эксперимента общее состояние животных всех групп не претерпевало каких-либо отрицательных изменений, их физиче- ская активность оставалась на уровне, зафиксированном в начале исследования. Вовлеченная конечность у животных контрольной группы (G1-группа) и из групп сравнения (G2–G5-группы) сохраняла опороспособность и подвижность. Изменения на местном уровне проявлялись лишь небольшой отечностью мягких тканей в области инъекций только в тех случаях, когда проводили моделирование тендинопатии путем введения стерильной 10%-й суспензии талька (G2–G5-группы). Патоморфологические изменения структуры сухожильной ткани, выявленные после завершения моделирования тендинопатии у животных G2-группы, заключались в возникновении очагового разволокнения коллагеновых волокон и дезорганизация их пучков. Наряду с этим, имели место признаки мукоидной и липоидной дегенерации, проявляющиеся метахромазией при окраске по Масону и толуидиновым синим, а также неоваскуляризации. Последняя, равно как и лимфоидно-гистиоцитарная инфильтрация с участками скопления нейтро-фильных лейкоцитов, наблюдалась в прилежащем к сухожилию паратеноне, а также жировой и мышечной тканях и в меньшей степени – непосредственно в самом сухожилии (рис. 2).

Отмеченные изменения в ткани пяточного сухожилия и в прилежащих мягких тканях в основном объяснялись вызванными тальком микроповреждениями, активирующими механизмы воспаления, включая цитокиновый каскад, металлопротеиназы, играющие, как известно, важную роль в метаболизме, деструкции и ремоделировании матрикса большинства соединительнотканных структур [5, 11, 16]. Подобные структурные нарушения на микроскопическом уровне в настоящее время рассматриваются в контексте механической теории развития патологии сухожилий, а для их обозначения используются термины тендинопатия, тендиноз или тендинит [7, 10]. Выявление характерных гистологических признаков указанных патологических процессов в нашей экспериментальной модели подтверждало её адекватность для решения поставленных в исследовании задач.

Локальное введение ОТП (G3-группа), гиалуроновой кислоты (G4-группа) или их сочетания между собой (G5-группа) кратностью 1 раз в неделю в течении 3 недель показало изменение морфологического профиля ткани в области смоделированной тендинопатии. Проявления дезорганизации и дегенерации коллагенового матрикса, воспалительного процесса в окружающих сухожилие мягких тканях имели меньшую выраженность по сравнению этими процессами, наблюдавшимися в препаратах у животных G2-группы, которым лечение не проводили (рис. 3).

а                             б

Рис. 2. Модель тендинопатии пяточного сухожилия: участки разволокнения, мукоидной дегенерации, околосухожильной очаговой лимфогистиоцитарной инфильтрации. Окр. гематоксилином и эозином, ув. ×100 (а) и по Масону, ув. ×400 (б)

а                              б

в                                         г

д

Рис. 3. Модель тендинопатии пяточного сухожилия в условиях локального введения ОТП (а, б), ГК (в, г), ОТП+ГК (д, е). Окр. гематоксилином и эозином, ув. ×100 (а, в, д) и по Масону, ув. ×400 (б, г, е)

е

В наибольшей степени положительная динамика характеризовала морфогенез тендино-патии в условиях введения ОТП или ОТП и ГК.

Противовоспалительное действие ОТП, отмеченное в нашем исследовании, было вполне ожидаемым явлением, обусловленным, главным образом, факторами роста, содержащимися в α-гранулах тромбоцитов, способными оказывать регулирующее воздействие на все три фазы воспалительного процесса посредством взаимодействия с трансмембранными рецепторами клеток и инициации внутриклеточных сигналов [12, 14].

Не меньшего, а может быть и большего внимания достойно еще одно свойство ОТП, которое проявилось в виде защиты ткани сухожилия от разрушения, дегенерации (тендопротек-тивный эффект) и восстановления его после повреждений (репаративный эффект). Развитие репаративных процессов в этом случае также находит объяснение с позиций участия факторов роста тромбоцитов ОТП, которые влияют на экспрессию генов в ядрах клеток с усилением синтеза белков, регулирующих их пролиферативную и синтетическую активность. Кроме этого, факторы роста тромбоцитов стимулируют хемотаксис, дифференциацию клеток и локальный ангиогенез, что имеет непосредственное отношение к процессам восстановления поврежденных сухожилий [12, 17]. В результате взаимодействия ОТП с тканью сухожилий рядом авторов отмечалось усиление пролиферации фибробластов, синтеза коллагена 1-го и 3-го типов теноцитами, фибробластами, миграция клеток-предшественников из костного мозга в область повреждения сухожилий, увеличение размеров и прочности регенерата, улучшение гистологических и механических характеристик костно-сухожильного прикрепления [4, 3, 7, 12, 17].

В качестве альтернативного ОТП ортобио-логического препарата у животных G4-группы была выбрана гиалуроновая кислота, также известная своим противовоспалительным действием и способностью стимулировать синтез протеогликанов – одного из компонентов матрикса ткани сухожилия [4, 9]. Вероятно, благодаря этим свойствам проявился, наблюдавшийся в нашем исследовании, тендопротектив-ный эффект ГК.

Дегенерация сухожилия у животных G4-группы достигала меньшей степени по сравнению с подобными процессами, отмеченными через 10 недель после моделирования тенди-нопатии в группе G2, но отличалась в худшую сторону от гистологической картины структурной организации сухожилий после инъекций

ОТП или ОТП и ГК. Причем изучение защитных и восстановительных возможностей последней комбинации при тендинопатиях представляется перспективным для последующих экспериментальных и клинических исследований.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Экспериментальная модель, основанная на введении в область пяточного сухожилия крысы 0,5 мл 10%-й суспензии стерильного талька в течение 6 недель по 2 инъекции в неделю, характеризуется возникновением гистологических признаков тендинопатии – нарушением структуры тканей, очаговым воспалением и сосудистой пролиферацией.

Введение ОТП в область пяточного сухожилия в качестве монотерапии или в сочетании с гиалуроновой кислотой в условиях экспериментальной модели тендинопатии уменьшает проявления воспалительного процесса, способствует сохранению и, возможно, восстановлению его нарушенной структуры.