Экспериментальная оценка радиомодифицирующих свойств солей кальция

Широкие масштабы мирного использования атомной энергии в медицине, сельском хозяйстве, энергетике, промышленности, исследовании космоса, а также возникновение аварийных ситуаций на атомно-энергетических комплексах представляет потенциальную опасность для жизни людей и сельскохозяйственных животных как в настоящее время, так и в будущем. Поэтому, несмотря на многолетний поиск высокоэффективных средств противолучевой защиты, интерес к ним не снижается, а, наоборот, возрастает. Опасность для жизни и здоровья людей и животных представляют не только открытые источники ионизирующего излучения, но и продукты питания, загрязнённые радионуклидами природного и искусственного происхождения.

Из многочисленных средств противолучевой защиты организма: физико-химических (цистеамин, цистамин, мексамин, цистофос, амитурон и др.), биологических (пересадка костного мозга, гипоксия, препараты элеутерококка, женьшеня, лимонника, витаминно-аминокислотный

Иванов В.Л.* – ст. научн. сотр., к.в.н.; Панфилова В.В. – научн. сотр., к.б.н.; Чибисова О.Ф. – научн. сотр. МРНЦ им. А.Ф. Цыба – филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России.

комплекс, микроэлементы, вакцины (брюшнотифозная, протейная), продигиозан (микробный полисахарид), дедоксинат (деградированная ДНК), индралин, интерлейкин-3 и др., а также комбинированных методов защиты с помощью физических (экранирование отдельных участков тела) и химических средств не всякий препарат, зарекомендовавший себя положительно в опытах на животных, может быть использован в медицинской практике в качестве индивидуального средства защиты людей [1-4]. Как отмечают авторы [1], к препаратам, предназначенным в качестве индивидуальных радиозащитных средств, должны быть предъявлены, как минимум, следующие требования:

• •    препарат должен быть достаточно эффективным и не вызывать выраженных побочных эффектов;

• •    действовать быстро и сравнительно продолжительно, как минимум 4-8 часов;

• •    быть не токсичным, с терапевтическим коэффициентом не менее 3;

• •    не должен вызывать даже кратковременного снижения, а тем более потери трудоспособности, не ослаблять приобретённые навыки в управлении;

• •    иметь удобную для приёма лекарственную форму (таблетка, шприц-тюбик, драже, пилюля, капсула);

• •    не должен оказывать вредного влияния на организм при многократных повторных приёмах, не должен обладать кумулятивным действием;

• •    не должен снижать устойчивость организма к другим неблагоприятным факторам внешней среды;

• •    должен быть устойчивым при хранении: защитные и фармакологические его свойства не должны уменьшаться при хранении не менее 3 лет.

Несмотря на значительные успехи, достигнутые в области профилактики лучевых поражений в экспериментальных условиях, реальная возможность использования химических средств для защиты человека окончательно не решена. В качестве основной причины, препятствующей практическому применению препаратов, авторы отмечают их высокую токсичность, определяющую малую терапевтическую широту (диапазон между токсичными и эффективными дозами) препаратов. Кратковременность защитного эффекта также следует отнести к существующим недостаткам радиопротекторов. Это фармакологическое свойство затрудняет их использование при пролонгированном облучении.

Препараты биологической защиты, в отличие от радиопротекторов, не обладают специфическим действием, а способны только повышать общую сопротивляемость организма к различным неблагоприятным факторам, в том числе к радиационному воздействию. Такого рода вещества (адаптогены) должны быть безвредными для организма, обладать большой широтой терапевтического действия, вызывать минимальные сдвиги в нормальных функциях организма или вовсе их не изменять и проявлять своё адаптогенное действие только на соответствующем фоне. Действие адаптогена должно быть неспецифично в том смысле, что должна повышаться сопротивляемость организма к вредному влиянию широкого набора физических, химических и биологических факторов. Оно должно быть тем более выражено, чем неблагоприятные сдвиги в организме. И, наконец, адаптоген должен обладать нормализующим действием независимо от направленности предшествующих сдвигов [5].

Анализ многочисленных публикаций по экспериментальной апробации различных фарм-и биопрепаратов в качестве модификаторов лучевого поражения позволил нам остановиться на адаптогенах, в состав которых входит кальций. Биологическая роль Са в организме весьма значительна. Помимо того, что этот элемент составляет основу скелета (98%), его присутствие обнаруживается в составе всех тканей и крови, значительная его часть входит в комплексы с белками. Концентрация кальция в тканях, особенно в сыворотке крови, стабильна, отклонения содержания Са2+ в крови хотя бы на 2-3 мг в ту или иную сторону приводят к нарушениям, зачастую не совместимым с жизнью [6]. Однако, следует отметить, что избыточное поступление кальция в организм или недостаток его находятся под постоянным контролем костной ткани, обладающей способностью мгновенно поглощать избыток кальция, поступающего в кровь из ЖКТ, тем самым, поддерживать его гомеостатический уровень в крови. Эти процессы происходят при участии паратгормона паращитовидной железы и тиреокальцитонина щитовидной железы [6, 7]. Участвуя в физиологических процессах, кальций понижает возбудимость нервной системы, уменьшает способность связывать воду тканевыми коллоидами, понижает клеточную проницаемость, возбуждает деятельность сердца, участвует в процессах свёртывания крови, активирует ферменты актомиозин-АТФазу и лецитиназу, тормозит функции енолазы, дипептидаз и других ферментов [8].

Многочисленные публикации свидетельствуют о достаточно высокой радиозащитной роли кальция при внешнем остром и хроническом поражении организма источниками ионизирующего излучения, а также при действии инкорпорированных радиоактивных веществ [6, 9-14].

С учётом вышеизложенного, целью настоящего исследования явилось выяснение влияния вводимых с кормом солей кальция в виде глюконата кальция (СКГ) и углекислого кальция (СКУ), как отдельно, так и в сочетании с витаминами А и Д 2 (рыбий жир), на течение и исход лучевой болезни мышей.

Материалы и методы

Эксперимент проведён на 249 беспородных мышах-самках в возрасте 2,5 мес. массой 25,0-27,5 г. Животные содержались в условиях вивария при комфортном тепловом режиме и получали стандартный рацион на основе брикетированного корма. Однократное общее облучение животных гамма-лучами 137Сs проводили на установке «Гамма-Панорама» в дозе 8,0 Гр при мощности дозы 2,0 Гр/мин.

Препараты кальция (глюконат и углекислый) в виде порошка тщательно смешивали с размельчённым и слегка увлажнённым брикетированным кормом из расчёта 0,1 г на одно животное в сутки. Витамины А (ретинол) и Д 2 (эргокальциферол) в виде очищенного для внутреннего применения рыбьего жира ( oleum jecoris depuratum pro usum interno ) вводили per os по 1 капле ежедневно в соответствии с временем применения кальциевых препаратов. Суточная доза витамина А приблизительно составляла 10 МЕ (международные единицы), а витамина Д 2 – 1 МЕ на животное.

Из экспериментальных животных было сформировано 7 групп:

• 1    группа (57 особей) – биологический контроль;

• 2    группа (13 особей) – соль кальция углекислого (СКУ) вводили в корм в течение10 дней (5 дней до и 5 дней после условного дня облучения);

• 3    группа (63 особи) – облучение в дозе 8 Гр;

• 4    группа (45 особей) – СКУ в течение 3-7 дней до и 6-10 дней после облучения;

• 5    группа (20 особей) – СКУ + рыбий жир в течение 4 дней до и 6 дней после облучения;

• 6    группа (21 особь) – соль кальция глюконата (СКГ) + рыбий жир в течение 4 дней до и 6 дней после облучения;

• 7    группа (30 особей) – СКУ в течение 6 дней, начиная с 4 дня после облучения.

В динамике эксперимента регистрировали следующие показатели: массу тела животных, как интегрального показателя, отражающего уровень и интенсивность обменных процессов в организме животных, и 30-суточную выживаемость животных, показатели которой достаточны для оценки эффективности действия препаратов в экспериментах на лабораторных животных.

Результаты экспериментов обработаны статистически с использованием параметрических и непараметрических критериев вариационной статистики, в частности, альтернативного критерия Х 2 , а также был использован анализ таблиц сопряжённости 2 x 2. Проведён сравнительный анализ выживаемости в группах наблюдений i=4-7 c данными наблюдений i=3, где присутствовал только фактор облучения и отсутствовали препараты кальция и витамины, то есть в качестве контроля использовалась группа 3. Данные наблюдений за определённый период времени представлены в табл. 1, в ней показано отношение шансов (OR) выжить в сериях опытов по отношению к контролю (i=3), которое равно OR=a*d/(b*c). Различия признавали значимыми при р<0,05 [15, 16].

Таблица 1

Таблица сопряжённости 2 x 2

	i>3	i=3 (контроль)
Выжившие	а	b	a+b
Умершие	с а+с	d b+d	c+d a+b+c+d

Доверительные 95% пределы для OR определялись из приближения Корнфельда (Cornfield) [16].

Результаты и обсуждение

Динамика массы тела мышей, как интегральный показатель, отражающий уровень и интенсивность обменных процессов в организме подопытных животных в условиях облучения и применения радиомодифицирующих веществ, представлена в табл. 2.

Таблица 2

Динамика средней массы тела мышей после общего гамма-облучения в дозе 8,0 Гр на фоне применения препаратов Са (% к исходному значению)

№ группы	Число мышей	Время после облучения, сут
		5	10	15	20	25	30
1	57	110,8	111,6	116,8	121,6	121,8	122,8
2	13	100,0	107,6	109,2	120,4	124,0	128,0
3	63	97,7	98,5	104,4	105,9	107,3	106,8
4	45	98,0	101,6	106,3	109,9	113,4	119,4
5	20	98,9	92,1	95,7	98,9	104,3	107,9
6	21	92,4	90,2	93,8	97,1	101,1	102,4
7	30	108,6	109,8	112,0	113,9	114,2	116,2

Примечание: группа 1 – биологический контроль; группа 2 – СКУ в течение 10 дней (5 дней до и 5 дней после условного дня облучения); группа 3 – облучение в дозе 8 Гр; группа 4 – облучение в дозе 8 Гр + СКУ в течение 3-7 дней до и 6-10 дней после облучения; группа 5 – облучение в дозе 8 Гр + СКУ в течение 4 дней до и 6 дней после облучения + витамины Д и А (рыбий жир); 6 группа –облучение в дозе 8 Гр + СКГ в течение 4 дней до и 6 дней после облучения + витамины Д и А (рыбий жир); 7 группа – облучение в дозе 8 Гр + СКУ в течение 6 дней с 4 дня после облучения.

Результаты исследования показывают, что прирост живой массы мышей в течение 30 суток наблюдения достаточно динамичен. Однако, следует отметить, что применение СКУ (2 группа) к 30 суткам на 5,2% увеличивает прирост живой массы по сравнению с биологическим контролем, а некоторое снижение прироста живой массы в период наблюдения (5 и 6 группа), очевидно, связано с включением в корм рыбьего жира (витаминов А и Д). Однако, как будет отмечено ниже, препарат способствует некоторому повышению выживаемости животных по сравнению с введением в рацион только препаратов кальция.

Основным интегральным показателем эффективности любого противолучевого средства, как радиопротектора, так и лечебного препарата, является показатель выживаемости биообъекта. Результаты исследования представлены на рис. 1.

Группа 1

Группа 2

Группа 3

)|( Группа 5

Группа 6

Группа 7

Рис. 1. Выживаемость белых мышей в динамике экспериментов. Условия эксперимента представлены в «Примечании» к табл. 2.

На рис. 1 видно, что модель жёсткого лучевого воздействия (доза 8,0 Гр при мощности дозы 2,0 Гр/мин) приводит к более ранней гибели животных (с 3-5 суток после облучения). Применение препарата СКУ (2 группа) не вызывает каких-либо нежелательных эффектов у подопытных животных и сохраняет к 30-м суткам 100%-ую выживаемость. Введение в рацион СКУ, согласно схеме эксперимента (4 группа), на фоне лучевого воздействия увеличивает выживаемость животных на срок 30-е сутки после облучения с 31,7% (3 группа) до 80,0% (р<0,01). Дополнительное включение в рацион, кроме солей кальция, рыбьего жира (группы 6 и 5) увеличивает выживаемость мышей, которая составляет соответственно 90,5% и 95% (р<0,01). Интересно отметить, что отсроченное применение СКУ с кормом, начиная с 4 дня после облучения (7 группа), также достаточно значимо (р<0,01) повышает выживаемость подопытных животных по отношению к облучённому контролю (до 80%). С учётом того, что разгар острой лучевой болезни при данном уровне доз радиации регистрируется через 10-15 суток, представляет интерес анализ «ранней» зависимости от применённых лечебных подходов. Сравнительный статистический анализ выживаемости животных подопытных групп, проведённый на 15-е сутки после облучения, показал высокую значимость различий между группами с применением препаратов (группы 4-7) и облучённым контролем (группа 3). При этом значения критерия Х2 варьировали от 10,4 до 15,8 (р<0,01). Следует отметить, что при применении этого альтернативного критерия на 30-е сутки эта разница была ещё более выражена, Х2 имел значение от 15,5 до 22,7 (р<0,01).

Статистическая обработка с применением анализа таблиц сопряжённости 2 x 2 на периоды наблюдения (15 и 30 сутки) представлена в табл. 3.

Таблица 3

Значение OR

Номер опыта	Период наблюдения 15 сут (95% ДП)	Период наблюдения 30 сут (95% ДП)
4	5,78 (2,47; 13,92)	8,60 (3,69; 20,53)
5	23,75 (3,80; 382,55)	40,85 (6,44; 663,58)
6	11,88 (2,86; 64,96)	20,42 (4,85; 113,19)
7	5,00 (1,92; 13,63)	8,60 (3,23; 23,93)

Как следует из табл. 3, во всех опытах с применением препаратов кальция и витаминов выживаемость статистически значимо выше, чем в контроле, и эффект применения препаратов достаточно велик.

Заключение

Результаты проведённого исследования свидетельствуют о том, что введение в рацион небольших количеств кальция приводит к повышению радиорезистентности организма. Известно, что под действием радиации, наряду со снижением уровня кальция в плазме крови, отмечается резкое (в 15 раз) увеличение его в структурах тканей [17], а это свидетельствует не о недостаточности кальция в организме, а о нарушении механизмов его обмена. Известные публикации и экспериментальные данные указывают не столько на прямую, сколько на опосредованную роль пищевого кальция в улучшении показателей лучевой патологии у животных, как при действии внешних факторов радиации, так и при действии инкорпорированных радиоактивных веществ [10, 13, 17]. Механизмы действия дополнительных количеств кальция, вводимых с рационом, очевидно, осуществляются через их действие на эндокринные клетки желудочнокишечного тракта [10]. А также в механизме радиозащиты важную роль играет система холинэ-стераза-ацетилхолин, и связанная с ней проницаемость клеточных мембран [18]. Поскольку имеются косвенные данные об активизации под влиянием кальция энтерохромофинных клеток ЖКТ [10], можно предположить, что определённый вклад в радиозащитный эффект вносит серотонин – секрет этих клеток.

Известно, что ионы кальция участвуют в процессах клеточного дыхания. Так, в больших количествах кальций действует как разобщитель процессов окислительного фосфорилирования в митохондриях клеток, а в малых количествах, напротив, стимулирует дыхательные процессы [19]. Возможно, этот механизм лежит в основе гипоксического состояния клеток при введении дополнительного количества кальция в облучённый организм и формирует радиомодифицирующий эффект.

Таким образом, в системе мер лечебно-профилактического характера, призванных обеспечить защиту организма в условиях внешнего или внутреннего облучения, определённую значимость могут иметь препараты кальция, вводимые в организм через ЖКТ. Эти препараты, на наш взгляд, в большей мере соответствуют тем требованиям [1], которые предъявляются как для индивидуальных, так и для коллективных радиозащитных средств.

Данная работа проводилась по Программе совместной деятельности по преодолению последствий чернобыльской катастрофы в рамках Союзного государства на период до 2016 года и в ходе выполнения тем государственного задания МРНЦ им. А.Ф. Цыба - филиала ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России за 2015-2016 гг. и первую половину 2017 г., промежуточные итоги выполнения которых нашли отражение в обобщающей публикации [20].