Экспериментальное исследование влияния пептидной терапии на реиннервацию и реваскуляризацию передней большеберцовой мышцы

Автор: Щудло Наталья Анатольевна, Филимонова Галина Николаевна

Журнал: Гений ортопедии @geniy-ortopedii

Рубрика: Оригинальные статьи

Статья в выпуске: 2, 2012 года.

Бесплатный доступ

По данным экспериментов на 34 взрослых беспородных собаках получены новые сведения о динамике изменений гистологического строения, стереологических характеристик и васкуляризации передней большеберцовой мышцы собак в процессе реиннервации, изучено влияние параневральных инъекций церебролизина на реиннервацию и реваскуляризацию мышцы.

Нерв, регенерация, мышцы, стереология, индекс васкуляризации

Короткий адрес: https://sciup.org/142121538

IDR: 142121538

Текст научной статьи Экспериментальное исследование влияния пептидной терапии на реиннервацию и реваскуляризацию передней большеберцовой мышцы

Проблема восстановления движений после травм периферических нервов была и остаётся актуальной, о чём свидетельствуют результаты клинического обследования пациентов в отдалённые сроки после реконструктивно-восстановительных операций. Например, через 3 года после микрохирургического шва срединного и локтевого нервов, пересечённых в резаных ранах на уровне дистальной трети предплечья, только у 68 % пациентов наблюдалась функционально значимая реиннервация мышц - восстановление сократительной функции до уровня M3-M5 (по шкале Highet), у 32 % получены неудовлетворительные результаты [14].

Широко известно, что денервация вызывает атрофию мионов, расширение соединительнотканных прослоек между пучками мышечных волокон, увеличение количества интерстициальной жировой ткани [4, 15]. Эти представления о денервационных изменениях скелетных мышц были существенно дополнены экспериментальными исследованиями последних десятилетий. Любая, в том числе денервационная, атрофия сопровождается транс -формацией структурных и метаболических типов мышечных волокон, появлением «гибридных» волокон [11]. По данным некоторых авторов, в денервированной мышце встречаются мионы, подвергающиеся дегенерации и гибели, механизм которой отличен от некроза и апоптоза [6]; деструктивные процессы стимулируют репаративный миогенез, но ещё задолго до начала гибели некоторых денервированных волокон обнаруживаются картины вторичного неомиогенеза [12]. В денервированных мышцах есть и гипертрофированные волокна; интерпретация этого феномена остаётся дискуссионной: не выяснена его связь с неполной денервацией или реиннервационными изменениями [4].

В процессе реиннервации размеры атрофированных мышечных волокон увеличиваются, происходит перестройка их метаболизма, однако полное восстановление морфофункциональных характеристик мышцы проблематично. Одна из главных причин заключается в грубых изменениях васкуляризации. Микроангиографические исследования [13] и данные сканирующей электронной микроскопии [8] свидетельствуют, что в процессе денервационной атрофии кровеносные сосуды мышцы утрачивают параллельное по отношению к мышечным волокнам расположение и приобретают извилистый ход, что, по мнению авторов, вызывает нарушения кровотока и структурные изменения микрососудов, в том числе дегенерацию значительной их части.

Изложенное выше определяет актуальность количественных сопоставительных исследований эффективности разных способов стимуляции ней- рорегенерации с учётом интегральных показателей тканевой организации и васкуляризации реиннер-вируемых мышц. В частности, представляется перспективным исследование эффектов пептидоми-метика церебролизина – препарата с заявленным нейропротективным, нейротрофическим и усиливающим оксидативный метаболизм действием. Воздействие церебролизина на регенерацию периферической нервной системы изучено в единичных работах [2, 9], сведения о его возможных влияниях на состояние реиннервирумых мышц в доступной литературе отсутствуют.

Цель исследования – сопоставительный анализ морфо- и стереологических характеристик передней большеберцовой мышцы собак при регенерации седалищного нерва в условиях аддитивной терапии церебролизином и нестимулированного контроля.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты проведены на 34 взрослых беспородных собаках, которым под внутривенным барбитуровым наркозом в асептических условиях ножницами Millesi рассекали седалищный нерв на уровне середины бедра и выполняли эпи-периневральный шов с применением микрохирургической техники (инструментарий фирмы Aesculap, нить фирмы Ethicon калибра 8/0, увеличение 8-16х микроскопа Opton). В опытной группе (n=21) в период от 3 дней до 1,5 месяцев после операции проводили курс из 20 инъекций церебролизина, который вводили по 0,5 мл параневрально 3-5 раз в неделю в область седалищной вырезки - на 3-4 см проксимальнее зоны перерезки и шва нерва. Морфологические исследования осуществляли через 2,5 месяца, 4, 6 и 12 месяцев после операции. В контрольной группе (n=13) в послеоперационном периоде не применяли каких-либо воздействий на процесс регенерации седалищного нерва, морфологические исследования проведены в те же сроки после операции. Для независимого контроля использовали данные по стереологическому анализу передней большеберцовой мышцы интактных собак (n=3).

При проведении экспериментальных исследований руководствовались требованиями приказов № 1179 МЗ СССР от 10.10.1983, № 267 МЗ РФ от 19.06.2003, «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», «Правилами по обращению, содержанию, обезболиванию и умерщвлению экспериментальных жи- вотных», утвержденными МЗ СССР (1977) и МЗ РСФСР (1977), принципами Европейской конвенции (Страсбург, 1986) и Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации о гуманном обращении с животными (1996).

Фрагменты передней большеберцовой мышцы оперированной и контралатеральной конечностей фиксировали в смеси равных объемов 2 % растворов параформ- и глютарового альдегидов с добавлением пикриновой кислоты, постфиксировали в 0,1% осмиевой кислоте, дегидратировали, заливали в эпоксидные смолы; полутонкие срезы окрашивали по M.Ontell. Из других фрагментов мышц изготавливали поперечные криостатные срезы и гистохимически выявляли в них активность миозиновой АТФ-азы (рН 9,0). Микропрепараты исследовали под световым микроскопом “Opton” (Германия). Для стереологического анализа использовали цифровые изображения микропрепаратов, которые получали и геометрически калибровали на АПК «ДиаМорф» (Россия). Точко-счётную объёмометрию проводили в программе PhotoFiltre, используя электронную версию оригинальной тестовой решетки [1], состоящей из 100 узлов с прозрачными центрами. В репрезентативной выборке изображений серийных срезов рассчитывали объёмные плотности мышечных волокон, микрососудов и эндомизия, численные плотности мышечных волокон и микрососудов, а также индекс васкуляризации.

РЕЗУЛЬТАТЫ

При микроскопии криостатных срезов установлено, что через 2,5 месяца после операции на нерве (1 месяц после окончания курса инъекций цере-бролизина) гистологическое строение исследуемой мышцы животных опытной группы существенно отличается от контроля. В продольных и поперечных срезах наряду с характерным для атрофированной мышцы увеличением извитости продольных кровеносных сосудов вокруг многих мышечных волокон выявляется большое количество циркулярно ориентированных сосудов (рис. 1, а и b). В поперечных криостатных срезах определяется атрофия мышечных волокон, как с низкой, так и высокой интенсивностью реакции на АТФ-азу, визуально заметно увеличение численности функционирующих микрососудов как по сравнению с контролем, так и контралатеральной мышцей (рис. 1, b сравнить с d и с). В некоторых полях зрения в опытной группе уже на этом сроке начинает проявляться группировка однотипных волокон (рис. 1, b), что является характерным признаком реиннервации. У контрольных животных размерная вариативность мышечных волокон больше, что связано с характерной для денервированной мышцы преимущественной атрофией волокон одного типа; численность профилей функционирующих микрососудов в поперечных срезах увеличена по сравнению с контралатеральной мышцей, но не так, как в опыте; реакция на АТФ-азу в мышечных волокнах в большинстве полей зрения малоинтенсивна.

В полутонких срезах как опытных, так и контрольных животных наряду с атрофией мышечных волокон выявлены их дегенеративно-дистрофические изменения. Это проявляется вакуолизацией саркоплазмы, дезинтеграцией сократительного аппарата и появлением участков фокального некроза либо полностью дегенерировавших волокон (рис. 2). Наряду с этим выражены явления активной регенерации. Характерные скопления регенерационных ядер располагаются как по периферии, так и в центре трубок базальных мембран дегенерировавших мышечных волокон (рис. 2, b, e). Нередки волокна с сохранившейся поперечной исчер-ченностью, в которых выявляется парное расположение миобластов под базальной мембраной (рис. 2, a). И в опыте, и в контроле встречаются миотубообраз-ные волокна (рис. 2, с, d).

Рис. 1. Фрагменты криостатных срезов передней большеберцовой мышцы через 2,5 месяца после перерезки и шва нерва. Реакция на АТФ-азу, увеличение – 200×. a – продольный, b – поперечный срезы мышцы оперированной, c – контралатеральной конечности собаки опытной группы, d – опытной конечности контрольной группы

Рис. 2. Фрагменты продольных (a, b, c) и поперечных (d, e, f) полутонких срезов передней большеберцовой мышцы животных опытной (вверху) и контрольной (внизу) групп, окраска по M. Ontell, увеличение – 1250×, b – 500×. Срок эксперимента 2,5 месяца после операции. mb – парные миобласты, rn – регенерационные ядра, ms – активированный миосателлитоцит, mt – волокна в стадии миотуб, v – вакуоль в саркоплазме, V – вакуольная дегенерация мышечного волокна

Через 4 и 6 месяцев после операции и в опыте, и в контроле размеры мионов прогрессивно увеличиваются (рис. 3, a и b сравнить между собой и с рис. 1, b), но уменьшаются размеры и количество профилей микрососудов по сравнению с предыдущим сроком. В некоторых полях зрения восстанавливаются характерные для интактной мышцы паттерны мозаичного взаиморасположения мионов разных типов, вариативность диаметров мышечных волокон совпадает с таковой в контралатеральной мышце. Исследование полутонких срезов по-прежнему выявляет картины дегенерации и регенерации мышечных волокон (рис. 3, с), встречаются также и картины «подавленной» регенерации – явления гибели миобластов (рис. 3, d).

Через 12 месяцев после операции при исследовании криостатных срезов по-прежнему отмечается чередование полей зрения с группировкой волокон по типам и восстановленным мозаичным расположением мионов приблизительно равномерной величины. Также выявляются участки, где наряду с гипертрофированными волокнами (80 мкм диаметром и более) располагаются атрофичные денервированные волокна с ангулярными контурами, а также мелкие (менее 10 мкм в диаметре) округлые новообразованные волокна, что в большей мере выражено у 2 из 6-ти животных опытной группы (рис. 4, а). Ширина прослоек эндомизия увеличена у животных контрольной группы (рис. 4, c). При исследовании продольных полутонких срезов и в опыте, и в контроле выявляются участки фокального некроза и регенерации мышечных волокон (рис. 4, b). В контроле наряду с этим встречаются мышечные волокна, дегенерирующие на значительном протяжении (рис. 4, d).

Количественное исследование (табл. 1) показало, что через 2,5 месяца после операции в контроле и в опыте наблюдаются разнонаправленные изменения объёмной плотности мышечных волокон по сравнению с интактной мышцей: в опыте параметр снижен, в контроле повышен. Объёмная плотность микрососудов повышена как в опыте, так и контроле. Объёмная плотность эндомизия снижена в большей мере в контроле. Численные плотности мышечных волокон и микрососудов значительно превышают соответствующие интактные параметры, особенно в опыте. Индекс васкуляризации превышает интактный показатель в опыте, но снижен в контроле.

Через 4 месяца после операции объёмная плотность мышечных волокон выше интактного показателя, особенно в опыте. Объёмная плотность микрососудов по сравнению с предыдущим сроком в опыте снижается до интактного уровня, а в контроле становится ниже интактного показателя на 34,6 %. При этом объёмная плотность эндомизия по сравнению с предыдущим сроком возрастает почти до интактного уровня, а в опыте вдвое ниже интактного показателя. Численная плотность мышечных волокон по сравнению с предыдущим сроком снижается, но остаётся выше интактного параметра. Существенно то, что различие этого показателя в опыте по сравнению с интактным статистически незначимо. Численная плотность микрососудов значительно снижается по сравнению с предыдущим сроком, но в опыте она остаётся на 19,3 % большей интактного показателя, а в контроле снижена на 41,9 %. Индекс васкуляризации также уменьшается: в опыте он меньше интактного показателя на 8,6 %, а в контроле на 61,4 %.

Рис. 3. Фрагменты поперечных криостатных – активность АТФ-азы (вверху, увеличение – 200×) и продольных полутонких – окраска по M. Ontell (внизу, увеличение – 1250×) срезов передней большеберцовой мышцы животных опытной (a, b, с) и контрольной (d) групп. Срок эксперимента 4 (a) и 6 (b, с, d) месяцев после операции. С – картины дегенерации мышечных волокон, d – пример «подавленной» регенерации (гибель миобластов)

Рис. 4. Фрагменты поперечных (a, с, увеличение – 500×) и продольных (b, d, увеличение – 500×,1250×) полутонких срезов передней большеберцовой мышцы собак через 12 мес. после операции, окраска по M. Ontell. a, b - опыт; с, d - контроль; neo - новообразованные мышечные волокна, den – денервированные мышечные волокна, с – дегенерирующее мышечное волокно, mb – миобласт в зоне фокального некроза мышечного волокна

Таблица 1

Результаты стереологического анализа передней большеберцовой мышцы собак

Срок опыта

Параметры (М±m)

VVmf (мм3/мм3)

NAmf (мм-2)

VVmv (мм3/мм3)

NAmv (мм-2)

VVend (мм3/мм3)

Ivasc

Церебролизин

2,5 мес.

0,8827±0,0046*

2142,5±64,2*

0,0789±0,0046*

3111,3±125,9*

0,0385±0,0019*

1,452

4 мес.

0,9433±0,0021

657,4±16,9

0, 0259±0,0016

837,9±21,9

0,0308±0,0014

1,275

6 мес.

0,9496±0,0015

583,1±14,7

0,0196±0,0014*

695,6±20,9*

0,0313±0,0015

1,193

12 мес.

0,9549±0,0012*

418,9±6,4*

0,0117±0,0063

476,9±9,7

0,0334±0,0010*

1,139

Контроль

2,5 мес.

0,9293±0,0028

1162,56±28,9

0,0435±0,0028

1537,97±33,3

0,0265±0,0016

1,324

4 мес.

0,922±0,003

760,68±22,42

0,017±0,002

408,20±13,105

0,063±0,003

0,537

6 мес.

0,9455±0,0027

531,58±19,9

0,0291±0,0017

893,3±26,7

0,0255±0,0024

1,681

12 мес.

0,9304±0,0035

608,58±19,87

0,0171±0,002

508,03±15,34

0,0538±0,0032

0,835

Интактная группа

0,9083±0,0017

504,1±6,4

0,0256±0,0013

703±8,2

0,0662±0,0017

1,395

Примечание: M среднее значение, m стандартная ошибка; * – статистически значимые различия групп Церебролизин и Контроль; жирный шрифт – достоверное отличие от интактной группы (p<0,05).

Через шесть месяцев после операции объёмная плотность мышечных волокон превышает интактный показатель и практически не различается в опыте и контроле. Объёмная плотность микрососудов по сравнению с предыдущим сроком снижается в опыте, но возрастает в контроле, недостоверно превышая интактный параметр. Объёмная плотность эндомизия по сравнению с предыдущим сроком не меняется в опытной группе, но снижается в контроле. Численная плотность мышечных волокон уменьшается по сравнению с предыдущим сроком в опыте и, особенно, в контроле; различие этого параметра по сравнению с интактным как в опыте, так и в контроле статистически незначимо. Численная плотность микрососудов в опыте снижается по сравнению с предыдущим сроком и становится сопоставимой с интактным показателем. В контроле, напротив, данный параметр значительно возрастает и статистически значимо (на 27 %) превышает интактный показатель. Индекс васкуляризации в опыте ниже интактного на 15 %, в контроле превышает интактный уровень на 20 %.

Через 12 месяцев после операции в опыте продолжается увеличение объёмной плотности мышечных волокон, в контроле этот показатель снижается, хотя и не достигает интактного уровня. Численная плотность мышечных волокон в опытной группе достоверно снижена по сравнению с интактной мышцей и контролем, в контроле этот параметр достоверно больше относительно интактной мышцы. Численная плотность микрососудов в опыте и в контроле достоверно ниже интактного параметра. Индекс васкуляризации в опыте по сравнению с интактным показателем снижен на 18,6 %, в контроле – на 40 %.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Ранее выполненное нами исследование эффектов церебролизина на регенерацию седалищного нерва собак [2] показало, что в условиях применения препарата уменьшается частота и тяжесть нейротрофических расстройств, сокращаются сроки восстановления опорно-двигательной функции конечности; морфометрические показатели регенерирующего нерва свидетельствуют об ускорении аксоногенеза и процесса дифференцировки миелинизирующихся волокон; электромиографические исследования выявили тенденцию более интенсивного по сравнению с нестимулированным контролем прироста амплитуды моторных ответов в икроножной мышце и повышение вероятности более раннего появления M-ответов в передней большеберцовой мышце, а также их меньшую межиндивидуальную вариативность в ходе восстановления.

Результаты гистологических исследований передней большеберцовой мышцы, представленные в данной работе, позволили подтвердить, что в условиях применения препарата признаки реиннервации передней большеберцовой мышцы выявляются раньше, о чём свидетельствует лучшее, чем в контроле, восстановление интенсивности АТФ-азной реакции в мышечных волокнах, а также формирование группировок волокон с низкой и высокой активностью АТФ-азы уже через 2,5 месяца после операции.

Данные литературы об изменениях васкуляризации мышцы в процессе реиннервации ещё более противоречивы и отрывочны. Выполненное нами изучение динамики стереологических параметров показало, что в нестимулированном контроле изменения всех трёх параметров, характеризующих васкуляризацию (табл. 1 и рис. 5, 6), имеют волнообразный характер.

Рис. 5. Ординаты – численная плотность мышечных волокон (мм-2), абсциссы – срок эксперимента

Рис. 6. Ординаты – численная плотность микрососудов (мм-2), абсциссы – срок эксперимента

Рис. 7. Ординаты – индекс васкуляризации, абсциссы – срок эксперимента

В опытной группе через 2,5 месяца после операции (месяц после окончания курса церебролизина) наряду с повышением численной плотности микрососудов повышен и индекс васкуляризации не только по сравнению с нестимулированным контролем, но и интактной мышцей. Реваскуляризирующий эффект церебролизина проявляется и через 4 месяца после операции (2,5 месяца после его отмены), когда численные плотности мышечных волокон в опыте и контроле не имеют статистически значимых отличий, а численная плотность микрососудов в опыте более чем в два раза превышает контроль.

Следует подчеркнуть, что и в опыте, и в контроле достигнута верифицированная ЭМГ-исследованием функционально значимая реиннервация передней большеберцовой мышцы, однако её гистологическое строение имеет существенные отличия от интактной и в 6 месяцев, и даже через 12 месяцев после операции. Это проявляется неполным восстановлением мозаичного строения, наличием денервированных, гипертрофированных и деструктивно изменённых мышечных волокон, как в контроле, так и в опыте.

Известно, что волокна скелетной мускулатуры являются весьма вульнерабельными структурами, которые повреждаются даже собственным сокращением, особенно при непривычных физических нагрузках; эти повреждения включают разрывы сарколеммы и участки локального некроза мышечных волокон; первые репарируются в течение нескольких часов, вторые – от нескольких дней до 3 недель [9]. Протяжённые участки дегенерации саркоплазмы или дегенерация всего мышечного волокна, которые через 12 месяцев после опера- ции отмечены в контроле, прогностически менее благоприятны, даже если они не сопровождаются нарушением целостности базальной мембраны, поскольку в условиях недостаточной васкуляризации и истощения пролиферативного пула миосателли-тоцитов регенерация может оказаться подавленной.

Переход от денервационной атрофии и атрофии от бездействия к активным движениям неизбежно вызывает не только прогрессивные изменения (увеличение диаметров мышечных волокон и усиление васкуляризации мышцы), но и деструкцию мышечных волокон. С учётом этого обстоятельства становится понятной необходимость разработки длительной научно обоснованной реабилитационной терапии и оценки отдалённых результатов регенерации нерва, как в эксперименте, так и в клинике.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выполненное исследование показало, что при посттравматической регенерации седалищного нерва собак в ходе реиннервации передней большеберцовой мышцы первичные и вторичные параметры васкуляризации подвержены колебательным изменениям, которые не являются оптимальными для сохранения структуры сократительного аппарата в отдалённые сроки регенерации. Курс из 20 параневральных инъекций церебролизина, проведённый в течение 1,5

месяцев после операции, способствует более ранней реиннервации и поддерживает более высокий, чем в контроле, уровень васкуляризации на протяжении 4 месяцев после операции. Снижение стереологиче-ских параметров васкуляризации во втором полугодии опыта предположительно связано с более выраженной гипертрофией мышечных волокон в опытной группе по сравнению с контролем, что предполагается проверить в дальнейшем исследовании.

Статья научная