Экспериментальное обоснование метода оценки полулетальной дозы облучения для наземного моллюска Fruticicola fruticum M.

Влияние острого воздействия на живые организмы оценивается полулетальной дозой (ЛД 50 ), которая отражает тот уровень воздействия, при котором погибает 50% особей. Данный показатель применяется для описания острой токсичности, например, в токсикологии [1, 2], фармакологии [3, 4] и оценке воздействия радиационного облучения [5, 6].

В Публикациях МКРЗ отмечаются рекомендации по использованию показателя смертности как релевантного при изучении влияния радиационного фактора на представителей биоты [5, 7]. На данный момент существует большое количество методов расчёта ЛД 50 и возникает вопрос о выборе наиболее адекватного. При этом отсутствуют рекомендации относительно общепринятых алгоритмов или методов определения полулетальной дозы облучения представителей «non-human biota», что может приводить к искажению искомого показателя.

Целью данной работы является расчёт полулетальной дозы γ-облучения наземного моллюска Fruticicola fruticum M. двух возрастных групп разным инструментарием для обоснования наиболее корректного метода оценки ЛД 50 . При этом за критерий обоснования адекватного для оценки показателя алгоритма принимается максимальное совпадение полученных разными методами значений ЛД 50 .

Материалы и методы

Оценку полулетальной дозы облучения проводили для наземного моллюска F. fruticum M. второй и третьей возрастных групп. Возраст моллюсков определяли по количеству оборотов раковины [8, 9]. Пробоотбор моллюсков осуществляли на территории Калужской области близ национального парка Угра на удалённом расстоянии от промышленных предприятий, населённых пунктов и дорог. Моллюсков отбирали в августе, после чего транспортировали в лабораторию для адаптации к новым условиям обитания.

Облучение моллюсков производили на γ-установке ГУР 120 в диапазоне доз от 10 до 300 Гр с шагом 10 Гр. Мощность поглощённой дозы при облучении составляла 30 Гр/ч. Таким образом, облучали по 30 проб моллюсков каждой возрастной группы. Каждая проба содержит три повторности по 5 особей моллюсков. Уровень смертности регистрировали каждые 30 сут, протяжённость эксперимента составляет 210 сут.

Для обоснования более адекватного метода определение ЛД 50 для малого биологического объекта (наземного моллюска) проводили расчёт показателя несколькими способами: с помощью методов пробит-анализа с применением метода наименьших квадратов; с применением программной среды R; с применением онлайн-калькулятора ICARDA. Экспериментальные данные обрабатывались с помощью программного пакета Microsoft Excel 2019 и программного пакета R [10]. На графиках представлены средние значения и стандартная ошибка среднего. Для определения значимости различий между средними значениями изучаемых показателей и контролем использовался t-тест Стьюдента. Уровень доверия по умолчанию равен 95%.

Результаты и обсуждение

Следует отметить, что в период проведения эксперимента в контрольной группе наблюдается 100% выживаемость. Показатель смертности моллюсков двух возрастных групп достигает 50% уровня, начиная с 60 сут после облучения.

Метод пробит-анализа

Метод пробит-анализа широко применяется в различных научных областях, включая расчёт ЛД 50 [11-13], интерпретацию количественных зависимостей «доза-эффект» в фармакологии, токсикологии [14], изучение вероятных закономерностей распределения биологических видов [15].

Для расчёта ЛД 50 изначально строится линия регрессии по методу наименьших квадратов с использованием данных эксперимента. При этом используется прямолинейная зависимость, представленная не в общей форме ( y=a+bx ), а в следующей: y=a+blgD , где у’ - это пробит (пробит определяется по таблице, в которой каждому проценту смертности соответствует определённое число (пробит)), а lgD - десятичный логарифм от дозы, полученной испытуемыми животными. Подробный алгоритм расчёта ЛД 50 для наземного моллюска разных возрастных групп приведён в работе [6].

На основании полученных экспериментальных данных установлено достоверное снижение показателя ЛД 50 с течением времени после облучения для двух возрастных групп наземного моллюска (рис. 1). При этом снижение показателя происходит от 115,6 до 24,2 Гр с шагом 1,4 раза (вторая группа) и от 141,4 до 63,6 Гр с шагом 1,2 раза (третья группа) через каждые 30 сут после облучения.

Рис. 1. ЛД 50 для наземного моллюска (расчёт методом пробит-анализа с применением метода наименьших квадратов).

Во временном диапазоне 120-210 сут после облучения отмечается достоверное (p<0,05) превышение в 2 раза показателя смертности моллюсков третьей возрастной группы над смертностью второй группы.

Ввиду того, что через 30 сут после облучения смертность моллюсков экспериментально не достигает уровня 50%, значение ЛД50/30 определялось расчётным методом. Метод пробит-анализа позволяет вычислить соответствующие значения, но с высокой погрешностью (более 100%). При этом значения показателя составляют 10077 Гр (вторая группа) и 4225 Гр (третья группа) и существенно превышают аналогичные значения (от 20 до 200 Гр), представленные в публикациях [16].

Программная среда R

Оценка показателя ЛД 50 посредством программной среды R осуществляется посредством построения моделей зависимости «доза-эффект». При анализе данных с помощью программы R обрабатывается весь массив данных, что предполагает объединение повторностей измерения. На основании полученных экспериментальных данных после облучения моллюсков построены линейно-пороговые модели изменения показателя смертности при увеличении дозы облучения [9, 17]. В дальнейшем расчёт ЛД 50 проводится по методу наименьших квадратов.

По результатам расчётов значений ЛД 50 в программной среде R так же, как и при обработке данных методом пробит-анализа, отмечается уменьшение показателя каждые 30 сут после облучения в среднем в 1,3 раза (от 150,6 до 48 Гр) и 1,2 раза (от 168,6 до 94,5 Гр) для второй и третьей возрастных групп соответственно (рис. 2).

80 о

60 СП

60        90        120       150       180       210

Время после облучения, сут

Вторая возрастная         Третья возрастная

Рис. 2. ЛД 50 для двух возрастных групп, рассчитанных программной средой R на основании линейно-пороговой модели.

При этом на протяжении всего периода наблюдений, начиная с 60 сут, значения показателя ЛД 50 второй возрастной группы в среднем в 1,3 раза ниже аналогичных значений третьей возрастной группы. Следует отметить, что смертность моллюсков через 30 сут после облучения не имеет линейно-пороговой зависимости и, следовательно, расчёт ЛД 50/30 не осуществлялся.

Онлайн-калькуляторы

Наиболее распространённым и доступным онлайн-калькулятором является ICARDA [18]. В приложении ICARDA ЛД 50 рассчитывается с помощью логит-функции Дж. Берксона:

Рг(х) =---- 1   ' .                                                     (1)

4 '    1+е—(а+Ьх)                                                                ' 1

Веб-приложения ICARDA для расчёта показателя ЛД даёт достаточно широкий набор возможностей, включая определение погрешностей; графическую визуализацию результатов; алгоритм применяемых методов; установление уровня доверительного интервала (от 0 до 100); выбор значения ЛД (ЛД0, ЛД10, …, ЛД100); выбор функции для расчёта (логит- или пробит-функции).

Показатель ЛД 50 , рассчитанный онлайн-калькулятором, также имеет тенденцию к снижению с течением времени (рис. 3). Каждые 30 сут показатель уменьшается в 1,7 раза (от 503±08 до 38±5 Гр) во второй группе и 1,4 раза (от 427±57 до 83 Гр) в третьей возрастной группе. При этом отмечается резкое снижение показателя на 60 сут по отношению к 30 сут (в 3,5 и 2,5 для второй и третьей групп соответственно).

Снижение показателя ЛД 50 с увеличением времени после изучаемого фактора воздействия также отмечаются и другими исследователями. Например, при исследовании токсичности Cd для Eisenia andrei при увеличении срока эксперимента отмечается снижение ЛД 50 в 2 раза [19].

При сравнении значений ЛД 50 для второй возрастной группы, рассчитанных разными методами, установлено, что наибольшие значения получены при расчёте в программной среде R, наименьшие – методом пробит-анализа (рис. 4).

600 Q_

Время после облучения, сут

Вторая возрастная         Третья возрастная

l_

500 s

300 о

200 о Cl

Рис. 3. ЛД 50 для двух возрастных групп, рассчитанных в онлайн-калькуляторе ICARDA.

60       90       120      150      180      210

Время после облучения, сут

Метод пробит-анализа      программная сред R      ICARDA

Рис. 4. ЛД 50 для второй возрастной группы.

Полулетальная доза, полученная с помощью программной среды R, в 1,7 и 1,2 раза выше, чем при расчёте методом пробит-анализа и ICARDA соответственно. При этом отмечается, что показатель ЛД 50/60 , рассчитанный тремя методами, не имеет достоверного отличия (p>0,05). Через 90-210 сут показатель ЛД 50 достоверно отличается (p<0,05) для трёх методов. Подобная картина наблюдается и при расчёте показателя ЛД 50 для третьей возрастной группы. При этом значения показателя, рассчитанные вышеуказанными методами, достоверно отличаются при оценке экспериментальных данных, полученных через 180-210 сут (p<0,05) (рис. 5). Значения полулетальной дозы, рассчитанные методом пробит-анализа, ниже в 1,5 раза расчётных значений посредством других методов.

В третьей возрастной группе динамика снижения показателя ЛД50 ниже, чем во второй возрастной группе. Так, при расчёте методом пробит-анализа за период эксперимента полулетальная доза снизилась в 2,2 раза (с 141 ±26 до 63±8 Гр), тогда как во второй возрастной группе снижение происходит в 4,8 раза (с 115±34 до 24±6 Гр). При расчёте в программной среде R происходит снижение в 1,8 раза (от 168 до 94,5 Гр) и 3,1 раза (от 150 до 48 Гр) в третьей и второй возрастных групп соответственно. В ICARDA динамика снижения показателя в третьей возрастной группе происходит в 2 раза (от 168±6 до 82±4 Гр), тогда как во второй – в 3,8 раза (от 145±8 до 38±5 Гр). Таким образом, с увеличение возраста моллюсков устойчивость к γ-облучению возрастает, что не противоречит результатам изучения радиобиологических эффектов у животных разного возраста. Например, в работе [20] отмечается, что у сеголеток мышей-полевок показатель полулетальной дозы выше, чем у созревших особей в 3 раза.

Q_ 160

о 120

>- 100

^ 80

СП 60

о d 40

60        90       120       150       180       210

Время после облучения, сут

^^^^^^^^^ Метод пробит-анализа ^^^^^^^в программная сред R        ICARDA

Рис. 5. ЛД 50 для третьей возрастной группы.

Заключение

Анализ проведённых оценок показателя ЛД 50 для моллюска F. fruticum M. двух возрастных групп разными алгоритмами показал следующее. При оценке показателя ЛД 50 через 30-60 сут (для второй возрастной группы) и 30-90 сут (для третьей возрастной группы) существенных отличий полученных значений показателя посредством трёх применяемых в данной работе методов не отмечается.

Значения показателя ЛД 50 , рассчитанные разным инструментарием, в более отдалённые сроки после облучения имеют различия для разных возрастных групп. При этом наименьшие значения показателя получены при расчёте методом пробит-анализа, наибольшие – посредством программы R. Диапазон значений ЛД 50 , полученных разными методами, для моллюсков второй возрастной группы составляет 50 Гр через 90 сут после облучения и имеет тенденцию к уменьшению до 25 Гр к окончанию эксперимента. При анализе полученных величин ЛД 50 для третьей возрастной группы отмечается различие между значениями, оценёнными разным инструментарием, в диапазоне 25-30 Гр в период 120-210 сут после облучения. При этом результаты расчёта показателя посредством программы R и ICARDA практически идентичны, а метод пробит-анализа, возможно, занижает расчётные значения показателя.

Таким образом, для моллюсков F. fruticum M. оценку ЛД 50 после острого γ-облучения в отдалённый период (90-210 сут и 120-210 сут для второй и третьей групп соответственно) целесообразно проводить посредством программы R или ICARDA. Для оценки ЛД 50 для моллюсков в первые месяцы после облучения применение всех изученных в данной работе алгоритмов не приводит к существенным различиям и три алгоритма могут применяться равноценно.