Экспериментальное обоснование введения кеналога в стекловидную камеру глаза после витрэктомии

Стремительное развитие современной витреорети-нальной хирургии (ВРХ) характеризуется внедрением усовершенствованных хирургических приемов, многие из которых являются по своей сути излишне радикальными. В итоге конечная благая цель достигается за счет дополнительных повреждений внутренних структур глаза [11, 15]. Вследствие этого развивается патологический воспалительный ответ, который в ряде случаев стимулирует развитие пролиферативной витреоретинопатии. В настоящее время все больше исследователей приходит к выводу, что для профилактики развития выраженного воспалительного ответа после операционной травмы необходимо применение фармакологических препаратов [7].

Наиболее широкое клиническое применение в офтальмологии в последнее время нашли глюкокортикостероиды (ГКС) [4, 5, 7]. Как известно, ГКС оказывают угнетающее воздействие на все фазы воспалительного процесса [6, 7]. Для лечения патологии заднего отдела глаза ГКС применяются в виде местных периокулярных (парабульбарных, ретробульбарных и субтеноновых) инъекций [2].

В начале 80-х годов прошлого столетия Machemer R. с соавторами впервые исследовали в эксперименте возможность интравитреального введения ГКС. Данный способ имеет ряд преимуществ: в витреальной полости создается высокая внутриглазная концентрация препарата, увеличивается время его воздействия непосредственно на очаг поражения, значительно уменьшается системное побочное действие [22].

В настоящее время, в офтальмологии наиболее часто применяется препарат группы ГКС – триамцинолона ацетонид (ТА) – твердая кристаллическая структура которого и медленная растворимость в водной среде определяет длительное воздействие. Несмотря на то, что Кеналог (коммерческая форма триамцинолона) не предназначен для интравитреального введения, в современной литературе появляется все большее количество публикаций об эффективности данного пути введения при лечении рефрактерного макулярного отека и неоваскуляризации сетчатки и хороидеи [17, 20, 21, 23, 25]. В то же время имеются сообщения об отсутствии преимущества данного пути введения препарата по сравнению с более безопасным – субтеноновым [12, 16, 18]. Данные литературных источников указывают наиболее часто используемую для интравитреального введения дозу Кеналога в 0,1 мл, однако, мнения о побочном действии указанной дозы на морфологию и функцию сетчатки расходятся [17, 19, 20, 21, 24, 26]. Также в доступной литературе нами не найдено данных о безопасности введения Кеналога в авитреальный глаз. Вышеизложенные факты обозначили актуальность проблемы и послужили предметом настоящего исследования.

Целью работы явилось экспериментальное обоснование профилактического введения Кеналога в полость глаза после витрэктомии.

Задачи исследования

• 1.    Изучение в эксперименте биологического действия Кеналога при его введении в авитреальный и витреаль-ный глаз.

• 2.    Сравнение эффективности интравитреального и субтенонового введения препарата кеналог на экспериментальной модели операционной травмы.

Материалы и методы

Предметом исследования явился препарат с торговым названием Кеналог (Kenalog) (Bristol-Myers Squibb S.r.L., Италия). Для решения поставленных задач было выполнено 2 части экспериментального исследования. В первой части было изучено биологическое действие Кеналога на интраокулярные структуры и функцию сетчатки при его интравитреальном введении, во второй – его эффективность при данном способе введения.

Эксперимент был выполнен на кроликах породы Шиншилла весом от 2 до 2,5 кг, одинаковой окраски.

В первой части эксперимента биологическое действие препарата исследовали как при наличии стекловидного тела (СТ), так и после субтотальной витрэктомии (ВЭ).

Эту часть исследования выполняли на 4-х экспериментальных группах по 5 животных (10 глаз) в каждой: 1 группа (контроль) – после инъекции раствора BSS в СТ; 2 группа (контроль) – после ВЭ без введения Кеналога; 3 группа – после инъекции Кеналога в СТ; 4 группа – после ВЭ и введения Кеналога в СК (рис. 1, 2, 3 А и Б). Вводимая интравитреально доза препарата составяла 0,1 мл (4 мг активного вещества).

Прижизненные исследования включали в себя офтальмобиомикроскопию на 1, 7, 14, 21 и 30 сутки после операции; электроретинографию (ЭРГ) и тонометрию на 7, 14, 21 и 30 сутки. Для изучения динамики показателей ЭРГ учитывали процент сохранности амплитуды волны В по отношению к усредненным данным интактных глаз принятых за 100%. Амплитуда волны В характеризует биоэлектрическую активность внутренних слоев сетчатки и наиболее широко используется в клинической практике [1]. Уровень внутриглазного давления (ВГД) также выражали в процентах относительно нормальных показателей интактных глаз, принятых нами за 100%.

Конфокальную и световую микроскопию тканей глаза выполняли после энуклеации на 30 послеоперационные сутки. Для гистологического исследования энуклеированные глаза обрабатывали по общепринятой методике, гистологические срезы окрашивали гематок-силин-эозином.

Вторая часть эксперимента включала в себя исследование эффективности Кеналога вводимого в СК после ВРХ с целью профилактики воспалительно-пролиферативного ответа на операционную травму. Для этого выполняли ВЭ по стандартной методике. Для моделирования стандартной воспалительной реакции глаза на операционную травму по завершении ВЭ в полость глаза вводили 0,2 мл аутокрови. За основу взяли модель, описанную Сleary P. и Ryan S. (1979). Эффективность интравитреального введения Кеналога сравнивали с его субтеноновым введением. Эту часть исследования выполнили на 3-х экспериментальных группах, по 15 животных (30 глаз) в каждой: 1-ая группа (контроль) – после ВЭ и введения аутокрови в СК; 2-ая группа – после ВЭ с введением аутокрови и Кеналога в СК; 3-я группа – после ВЭ с введением аутокрови в СК и Кеналога субтеноново в дозе 0,5 мл. Методами исследования служили: офтальмобиомикроскопия, ЭРГ и световая микроскопия сетчатки. Сроки прижизненного наблюдения данной части эксперимента составили 1, 4, 7, 15 и 30 сутки. Микропрепараты для световой микроскопии готовили на 30 сутки.

Витрэктомию выполняли по стандартной методике с использованием офтальмохирургической системы «Oert-ly» (Швейцария), 2-х портовым доступом под контролем операционного микроскопа «Takagi OM-5», при увеличе-ниии 10,0х(Takagi, Seiko Co., Ltd, Япония) и скошенной (25 град.) контактной роговичной линзы (рис. 1, 2).

Животных выводили из эксперимента на 30 сутки после операции. Работу с экспериментальными животными выполняли в соответствии с требованиями нормативного документа Министерства Здравоохранения «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приказ МЗ СССР № 755 от 12.08.77).

Результаты и обсуждение

Полученные в 1-ой экспериментальной части результаты выявили отсутствие побочного влияния на орган зрения интравитреально введенного 0,1 мл Кеналога. На протяжении всего периода наблюдения (7–30 сутки) нами не отмечено каких-либо заметных изменений со стороны внутренних структур глазного яблока у животных всех групп: роговица и глубжележащие оптические среды оставались прозрачными; сохранялась живая реакция зрачка на свет; цвет и структура радужной оболочки оставались без перемен; каких-либо очаговых изменений со стороны сетчатки и зрительного нерва, которые можно было бы трактовать как результат побочного действия Кеналога, мы также не наблюдали. При этом, во 2-ой контрольной группе (ВЭ без введения препарата) офтальмобиомикроскопически отмечали признаки воспаления, связанного с хирургическим витреоретинальным вмешательством. Воспалительная реакция выражалась в хемозе, гиперемии конъюнктивы (100%) и опалесценции влаги передней камеры (30,0%), в подавляющем большинстве случаев эти признаки полностью купировались на 7 сутки послеоперационного наблюдения. Отсутствие каких-либо клинически заметных признаков воспаления со стороны прооперированных глаз у животных 4-ой группы (ВЭ с введением Кеналога) мы связываем с противовоспалительным действием препарата. Признаков воспалитель-

Рис. 1. Интравитреальная инъекция Кеналога

Рис. 2. Операция субтотальная витрэктомия

Табл. 1. Относительные показатели средней амплитуды волны В (%) электроретинограммы животных обеих групп в разные сроки первой части эксперимента

Группа	Период исследования
	7 сутки	15 сутки	21 сутки	30 сутки
Группа 1	86,1+4,3*	106,6+5,4	108,4+3,1	96,1+4,9
Группа 2	82,3+5,7*	88,3+3,9	105,3+4,2	112,8+5,1
Группа 3	122,6+5,2*	125,5+5,8*	115,1+3,8	107,5+4,3
Группа 4	108,7+3,7	97,5+4,3	106,4+5,4	109,3+3,9
Интактный глаз (норма)	100+5,6	100+5,6	100+5,6	100+5,6

* достоверная разница (р<0,05) между данным значением и значением интактного глаза ной реакции на 1-ые и последующие сутки в 1 и 3 группах, после интравитеральной инъекции, нами не отмечено.

Результаты нашего исследования соответствуют результатам наблюдений других авторов, которые отмечали повреждающее воздействие ВРХ на интраокулярные структуры с развитием изменений на тканевом уровне. По их данным витрэктомия без дополнительного медикаментозного лечения может вызвать соответствующий воспалительный ответ, а в ряде случаев – пролиферативную реакцию с формированием патологических мембран в стекловидной камере глаза [3, 10, 13]. Однако, по данным тех же авторов, в большинстве случаев изменения сетчатки после экспериментальной ВРХ носят обратимый характер и продолжительность активной воспалительной реакции ограничена. Уже на 30 послеоперационные сутки изменения в тканях оперированного глаза, отмеченные в течение первых двух недель после ВРХ, полностью разрешаются.

Достоверной разницы в уровне ВГД между контрольными и опытными группами нами отмечено не было. У всех животных оно сохранялось в пределах нормы. Это свидетельствует об отсутствии влияния данной дозы препарата на гидродинамику исследуемых глаз при введении его в СК.

Об отсутствии токсического влияния вводимой дозы Кеналога на ткани глаза свидетельствовали результаты гистологических исследований. Заметной разницы между препаратами тканей глаза опытных и контрольных групп нами выявлено не было (рис. 3А–Г).

На микропрепаратах всех групп видна правильная структура цилиарного тела с обычным клеточным составом, нормальным калибром сосудов, равномерной толщиной пигментного эпителия. Угол передней камеры открыт. Сетчатая оболочка имеет правильное строение с четкой дифференциацией всех составляющих ее слоев (рис. 4 А–Г). Наружный, внутренний зернистые слои и слой фоторецепторов хорошо выражены. Ретинальный пигментный эпителий сохраняет обычное строение. Ганглиозные клетки не изменены. Признаков патологических (дистрофических или/и воспалительных) изменений в слоях сетчатки, которые можно было бы связать с действием интравитреально введенного Кеналога, нами не отмечено.

Результаты конфокальной микроскопии эндотелиального пласта роговицы животных свидетельствуют об отсутствии качественных и количественных изменений эндотелиальных клеток и об идентичности микроскопической картины на опытных и контрольных глазах кроликов. Статистически достоверной разницы между средним количеством эндотелиальных клеток у интактных животных (2612+127 кл/мм2) и у животных каждой из опытных групп нами выявлено не было. На основании этого можно говорить об отсутствии повреждающего влияния Кеналога на структуры передней камеры глаза.

В отличие от данных приведенных выше результаты электрофизиологического исследования сетчатки

Рис. 3. Гистологическая картина тканей цилиарного тела (указано стрелкой) при изучении биологического действия препарата на 30 послеоперационные сутки. А – в 1-ой экспериментальной группе, Б – во 2-ой экспериментальной группе, В – в 3-ей экспериментальной группе, Г – в 4-ой экспериментальной группе. А, В, Г - увеличение х 50. Б - увеличение х 100

у животных экспериментальных групп отличались и меняли свое значение в течение периода наблюдения (табл. 1). Наиболее значительные функциональные изменения сетчатки зарегистрированы в первой половине послеоперационного периода у животных 1–3 групп по сравнению с нормой и 4-ой группой. Так, на 7-ые сутки в первых двух группах отмечали депрессию амплитуды волны В: в 1-ой – до 86,1+4,3% от среднего уровня нормы, во 2-ой – до 82,3+5,7%. Показатели биоэлектрической активности сетчатки у животных 3-ей опытной группы на 7–14 сутки, наоборот, характеризовались максимумом (в среднем до 122,6+5,2 – 125,5+5,8% от уровня интактного глаза). Проведенный нами статистический анализ показал достоверную разницу (р<0,05) между значениями амплитуды В волны ЭРГ животных каждой из 1–3 групп и интактными глазами в указанный период. Показатели ЭРГ в более поздние сроки у животных этих групп нормализовались. Заметных изменений электрогенеза сетчатки у животных 4-ой группы мы не наблюдали в течение всего периода наблюдения. Угнетение биоэлектрической активности сетчатки в 1-ой и 2-ой группах в первой поло- вине периода исследования можно объяснить влиянием операционной травмы, что соответствует наблюдениям других авторов [3, 8].

Отсутствие депрессии «b» – волны ЭРГ в 3-ей и 4-ой группах мы связываем с влиянием Кеналога, оказывающего угнетающее воздействие на все фазы воспалительного процесса с одновременным повышением устойчивости клеток к внешним воздействиям [5, 6]. Значительное возрастание амплитуды В волны в 3-ей группе на 7–14 сутки исследования мы связываем с более длительным нахождением препарата в витреальном глазу (по сравнению с авитреальным) и возможным его раздражающим действием на сетчатку [9]. Последующая нормализация ЭРГ свидетельствует о том, что отмеченные выше функциональные изменения носят обратимый характер. Отсутствие достоверной разницы амплитуды В волны ЭРГ между контрольными и опытными группами на 30 послеоперационные сутки свидетельствует о безопасности указанной дозы препарата при интравитреальном его введении, в т.ч. и в авитреальный глаз.

Рис. 4. Гистологическая картина тканей сетчатки глаза при изучении биологического действия препарата на 30 послеоперационные сутки. А – в 1-ой экспериментальной группе, Б – во 2-ой экспериментальной группе, В – в 3-ей экспериментальной группе, Г – в 4-ой экспериментальной группе. Увеличение х 400

Таким образом, нами не было выявлено каких-либо необратимых изменений со стороны внутренних структур витреальных и авитреальных глаз животных после введения Кеналога в СК.

Во 2-ой части эксперимента проводили изучение эффективности противовоспалительного и антипроли-феративного действия Кеналога после ВРХ в зависимости от методики введения препарата.

Регистрируемая нами воспалительная реакция со стороны переднего отрезка глаза в данной экспериментальной части носила значительно более выраженный характер по сравнению с наблюдениями в 1-ой части исследования и осложнялась ПВР. Это связано с провос-палительным действием введенной в СК аутокрови.

При офтальмобиомикроскопии на 1-ые послеоперационные сутки, в 1-ой группе (без введения Кеналога) мы наблюдали отек конъюнктивы и инъекцию поверхностных сосудов глаза в 100%. Во всех случаях в конъюнктивальной полости присутствовало слизисто-гнойное отделяемое. Опалесценцию влаги передней камеры отмечали в 60% наблюдений, серозный экссудат в передней камере

– в 30% (рис. 5А). Интраокулярную фибриноидную реакцию в передней трети стекловидной камеры отмечали в 53,3% наблюдений. Диффузное помутнение влаги СК, вызванное введением аутокрови, не позволяло оценить состояние сетчатки и зрительного нерва в течение первых 15 послеоперационных суток ни в одной из групп.

У животных 2 группы (введение Кеналога в СК авитреального глаза) на первые сутки в мы наблюдали лишь локальные хемоз и гиперемию конъюнктивы в области операционного разреза в 33,3% наблюдений (1-ая группа – 100,0%), опалесценцию влаги передней камеры – в 16,7% (1-ая группа – 60,0%) (рис. 5Б). Фибриноидную реакцию в передней трети стекловидной камеры регистрировали в 10,0 % наблюдений (1-ая группа – 53,3%). Экссудата в передней камере не наблюдали, в то время как у животных 1-ой группы подобную реакцию отмечали в 30,0%.

В 3-ей группе (введение Кеналога в субтеноновое пространство) хемоз и гиперемия конъюнктивы с незначительным слизистым отделяемым также носили локальный характер и визуализировались в 70,0% (во 2-

Рис. 5. Передний отрезок глазного яблока на 1-ые сутки после ВЭ и введения 0,2 мл аутокрови в СК (А), дополнительного введения 0,1 мл Кеналога в СК (Б), дополнительного субтенонового введения 0,5 мл Кеналога (В) (стрелкой указана смещенная в передний сегмент масса субтеноново введенного триамцинолона)

ой группе – 33,3% соответственно). Опалесценция влаги передней камеры у животных этой группы была отмечена нами в 36,7 % наблюдений (во 2-ой – 16,7%), экссудата в передней камере не было (рис. 5В). Фибриноидную реакцию стекловидной камеры отмечали в 23,3 % наблюдений (во 2-ой – 10,0%).

У животных 1-ой группы к концу 2-ой недели послеоперационного периода отмечали полное разрешение признаков воспаления переднего отрезка глаза, в то время как у животных 2-ой и 3-ей групп – данные признаки не регистрировались нами уже на 4-ые сутки. Более выраженный и длительный воспалительный процесс у животных 1-ой группы сопровождался более выраженной пролиферативной реакцией в полости глаза. Так, на 30-ые сутки, у животных 1-ой группы в СК визуализировали пролиферативные мембраны в 50 % наблюдений. Мембраны простирались от области скле-ростом в контралатеральном направлении или к диску зрительного нерва. При этом отмечали выраженную их плотность и ригидность (рис. 6А). Подобную реакцию у животных 2-ой группы не отмечали ни в одном случае (рис. 6Б), в 3-ей группе – только в 16,7 % наблюдений, но сформированные мембраны были менее плотными, сохраняли подвижность и располагались только в передней трети СК (рис. 6В). Гистологические исследования выявили значительную разницу состояния тканей глаза между экспериментальными группами. У животных 1-ой группы нами отмечены выраженные воспалительные изменения хороидеи и сетчатки в виде их диффузного отека и присутствия в них (и в остатках пристеночно расположенной крови) большого количества клеток воспалительного ряда (рис. 7А).

В большинстве случаев при микроскопии тканей глаза животных 2-ой группы отмечена лишь незначительная инфильтрация цилиарного тела, сетчатки и хоро-идеи единичными лимфоцитами, что можно объяснить противовоспалительным действием интравитреально веденного Кеналога (рис. 7Б).

В тканях глаз животных 3-ей группы в отличие от 2-ой наблюдали несколько более выраженную инфильтрацию лимфоцитами хороидеи (рис. 7В).

Результаты световой микроскопии второй части эксперимента свидетельствуют о том, что интравитре-альное введение Кеналога оказывает более благоприятное действие на весь воспалительный процесс по сравнению с субтеноновым его введением.

Результаты анализа ЭРГ (табл. 2) на 1-ые и 4-ые сутки после операции выявили достоверное снижение средней амплитуды В волны у животных всех 3-х экспериментальных групп: в пределах от 63,0+4,4 до 78,7+4,1% (р<0,05). В дальнейшем, во всех группах мы регистрировали нормализацию биоэлектрической активности сетчатки, но наиболее быстро восстанавливалось значение В волны во 2-ой опытной группе (после интравитреального введения Ке-налога): уже к 7 суткам после витрэктомии оно достигало исходной нормы. При этом, в 3-ей группе (субтеноновое введение препарата) исходных значений этот показатель достигал только к 15 суткам. У животных 1-ой группы (контроль) регистрировали наиболее значительное и длительное угнетение волны В, которое возвращалось к исходным данным только к 30 суткам наблюдения.

Полученные нами результаты электроретинографии коррелируют с результатами клинического и гистоло-

Табл. 2. Относительные показатели средней амплитуды волны В электро-ретинограммы (%) у животных опытных и контрольных групп в разные сроки второй части эксперимента

Группа	Период исследования
	1 сутки	4 сутки	7 сутки	15 сутки	30 сутки
Группа 1	66,7+7,4*	56,9+4,8*	69,3+4,4*	78,6+6,4*	93,7+4,9
Группа 2	73,7+5,8 *	78,7+4,1*	96,8+4,9	94,2+6,7	108,8+3,5
Группа 3	63,0+4,4*	65,7+3,2*	86,7+2,7*	108,4+4,1	105,6+6,7
Интактный глаз	100+5,6	100+5,6	100+5,6	100+5,6	100+5,6

* достоверная разница (р<0,05) между данным значением и значением интактного глаза

Рис. 6. Передняя треть СК на 30 сутки после ВЭ и введения 0,2 мл аутокрови в СК (А), дополнительного введения 0,1 мл Кеналога в СК (Б), дополнительного субтенонового введения 0,5 мл Кеналога (В)

Рис. 7. Гистологическая картина тканей заднего сегмента глаза при изучении эффективности на 30 сутки. А и Б – в 1-ой экспериментальной группе, В - во 2-ой экспериментальной группе, Г - в 3-ей экспериментальной группе. Увеличение х 400.

гического исследования: угнетение биоэлектрической активности сетчатки соответствовало выраженности воспалительного процесса. Так, максимальное угнетение функции сетчатки и медленное ее восстановление, отмеченное нами у животных 1-ой контрольной группы, регистрировали на фоне наиболее выраженной воспалительной реакции. Менее выраженная депрессия В волны ЭРГ у животных 2 и 3 групп соответствовала менее выраженной реакции глаза на операционную травму.

Таким образом, различные методы исследования, примененные нами во 2-ой части эксперимента, показали, что введение Кеналога в СК авитреального глаза более эффективно (по сравнению с субтеноновой его инъекцией) ингибирует воспалительно-пролиферативный ответ на операционную травму. Наряду с этим, результаты нашего исследования свидетельствуют о том, что введение Кенало-га непосредственно в СК является не только эффективным, но и безопасным методом профилактики воспалительнопролиферативного ответа после витрэктомии.

Выводы

• 1.    Кеналог дозой 0,1 мл, при введении в стекловидную камеру, не оказывает побочного действия на

• 2.    Интравитреальный путь введения Кеналога, по сравнению с субтеноновым, наиболее эффективно купирует послеоперационную воспалительно-пролиферативную реакцию.

внутриглазные структуры и функцию витреального и авитреального глаза.

38–41.