Экспрессии генов BIRC5 и HER2-neu в циркулирующих опухолевых клетках при хирургическом лечении рака молочной железы

Рак молочной железы (РМЖ) – одна из самых частых онкологических патологий. В течение последних десятилетий, в большинстве как развитых, так и развивающихся странах мира отмечается неуклонный рост заболеваемости данной патологией. Он занимает первое место среди злокачественных новообразований у женщин (не принимая во внимание рак кожи).

Опыт показывает, что при резектабельном раннем неметастатическом РМЖ после радикального проведенного лечения метастазирование наступит почти у половины пациенток в течение первых пяти лет, не зависимо от поражения регионарных лимфатических узлов [1].

В настоящее время метастатический РМЖ неизлечим, а метастазы приводят к смерти большинство пациентов, страдающих раком. В данном контексте на первый план выходит проблема возможного рецидива и, в свою очередь, подчеркивает важность минимальной остаточной болезни (МОБ).

МОБ определяется как присутствие опухолевых клеток в организме, которые не могут быть обнаружены на основе использования сегодняшних рутинных диагностических методов, применяющихся для определения стадии опухолевого процесса у онкологических пациентов после хирургического удаления первичной опухоли.

Большинство рецидивов возникает в течение первых 5 лет после постановки диагноза и проведения специального лечения, поэтому длительно живущие чаще женщины, будут считаться «вылеченными». Это следует рассматривать в контексте того факта, что исследование аутопсийного материала продемонстрировало наличие рака у людей, который при жизни не был диагностирован, а также, что у пациенток с РМЖ были обнаружены скрытые метастазы, не диагностируемые обычными методами визуализации при жизни. Это, наряду с пониманием метастатического процесса, является фундаментальной основой для изучения МОБ при РМЖ [2].

Следует обратить внимание, что циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК) предложено отнести к категории МОБ [3].

Изучение динамики опухолевого процесса позволило многим ученым сделать заключение о том, что РМЖ – это изначально диссеменированный опухолевый процесс, даже на доклинической стадии, который не может быть диагностирован традиционными методами обследования. А ЦОК являются непосредственным субстратом отдаленных метастазов [4].

Профессор К.Н. Bauer, основавший Немецкий центр онкологических исследований, в 1963 г. писал, что «с точки зрения хирурга, операция по поводу рака может быть названа радикальной лишь в том случае, если даже единичные раковые клетки удалены из организма» [5].

Принимая во внимание данное высказывание, очень важным является понимание роли и места хирургического этапа в лечении РМЖ с учетом наличия ЦОК как до начала специ- ального лечения при первичном неметастатическом РМЖ, так и возможного их сохранения после операции. Очень важным в контексте поиска ЦОК является методика идентификации последних. Принимая во внимание также данный вопрос перспективными маркерами для идентификации ЦОК могут рассматриваться такие гены, как ген антиапоп-тотического белка сурвивина BIRC5 и ген рецептора эпидермального фактора роста HER2-neu.

Материал и методы

В проспектовом исследовании приняли участие 162 пациентки с верифицированным первичным неметастатическим раком молочной железы (РМЖ), которые получали лечение в период 2015–2016 гг. в УЗ «Витебский областной клинический онкологический диспансер». Средний возраст пациенток составил 58,2±9,9 (M±SD) с индивидуальными колебаниями от 31 до 91 лет. Клиническая характеристика опухолевого процесса представлена в таблицах 1 и 2.

Таблица 1

Клинико-анатомическая характеристика первичной опухоли (n=162)

Категория, значение		n	%
T	1	87	53,70
	2	70	43,21
	3	4	2,47
	4	1	0,62
N	0	78	48,15
	1	63	38,89
	2	7	4,32
	3	14	8,64
Стадия	I	54	33,33
	IIA	54	33,33
	IIB	28	17,28
	IIIA	8	4,94
	IIIB	1	0,62
	IIIC	15	9,26

Всем женщинам были выполнены операции в объеме радикальной мастэктомии по Маддену – 113 (69,8%) или радикальной резекции молочной железы – 49 (30,2%).

У всех пациенток в день операции, а также на 2 сутки после операции забирался образец периферической крови из локтевой вены утором натощак в объеме 5 мл в стерильную вакуумную пробирку с К2ЭДТА для последующего обогащения и выделения ЦОК и хранился при 4°C до исследования. Образцы обрабатывались немедленно или не позднее, чем через четыре часа после забора крови.

Обогащение и выделение ЦОК проводилось с использованием технологии экспресс-выделения опухолевых клеток из цельной крови на основе ковалентно-связанных антител для CD326 на немагнитную полимерную матрицу крупных микросфер с последующей изоляцией ЦОК по размеру (S-pluriBead Maxi Reagent Kit and anti-human CD326 S-pluriBead, Германия).

Таблица 2

Патоморфологическая характеристика первичной опухоли (n=162)

Категория, значение		n	%
Морфологическое строение карциномы	тубулярная	1	0,62
	медулярная	3	1,85
	муцинозная	3	1,85
	неспецифическая	22	13,58
	дольковая	34	20,99
	протоковая	99	61,11
Степень дифференцировки	G1	5	3,09
	G2	71	43,83
	G3	86	53,09
Лимфо-венозно-сосудистая инвазия	LVSI+	136	83,95
	LVSI-	26	16,05
Молекулярно-биологический подтип опухоли	люминальный А	79	48,77
	люминальный Б HER2-	41	25,31
	люминальный Б HER2+	9	5,56
	гипер HER2 экспрессирующий	11	6,79
	трижды негативный (базальный)	22	13,58

Выделение мРНК из лизированных, обогащенных клеток проводилось в соответствии с инструкциями производителя наборов для выделения РНК (ООО СИВитал, Беларусь). Используя технологию обратной транскрипции синтезировали кДНК, которую использовали в последующем для анализа экспрессии генов в режиме реального времени. Для анализа экспрессии генов HER2-neu и BIRC5 использовали оригинальные тест-системы для определения экспрессии Survivin и Her2-neu cДНК транскрипции методом REAL-TIME ПЦР (ООО СИВитал, Беларусь).

Исследование одобрено этическим комитетом УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет», а также этическим комитетом УЗ «Витебский областной клинический онкологический диспансер»

Статистическая обработка данных

Статистическая обработка данных проводилась в соответствии с современными требованиями к проведению медико-биологических исследований. Качественные показатели представлены абсолютными и относительными величинами.

При проверке распределения на нормальность количественных признаков по критериям Лиллиефорса и Шапиро-Уилка, было установлено, что количественные признаки не подчиняются нормальному закону распределения. Характеристика данных количественных признаков представлена в виде медианы (Ме), интерквартильного диапазона (LQ/UQ), минимального и максимального значений (min, max).

При сравнении показателей, полученных в одной и той же группе пациенток до и после операции, применялся критерий Вилкоксона. При сравнении показателей в несвязанных группах в зависимости от объема оперативного вмешательства применялся критерий Манна-Уитни. Последний применяется для независимых выборок). Сравнение качественных номинативных данных проводили – по критерию хи-квадрат (χ2) Пирсона, по качественным бинарным – по критериям χ2 с поправкой Йетса и точному критерию Фишера в соответствии с условиями их применимости.

Во всех случаях различия считались статистически значимыми при уровне значимости р<0,05. Все значения р были двухсторонними. Статистическая обработка результатов произведена с использованием современных компьютерных программ.

Результаты исследования

Положительные мРНК BIRC5 и положительные мРНК HER2-neu ЦОК до оперативного вмешательства были обнаружены у 115 женщин (71%) из 162 пациенток с верифицированным первичным неметастатическим РМЖ. Исследование в динамике наличия и идентификации ЦОК по двум таргетным генетическим маркерам BIRC5 и HER2-neu после оперативного вмешательства выявило интересные факты. Так, после операции, мРНК BIRC5 положительные и мРНК HER2-neu положительные ЦОК исчезли у 47 (40,9%) пациенток, у которых они изначально определялись. Более чем в половине случаев – в 59 (51,3%) – идентифицируемые ЦОК сохранились в периферической крови. Более того, у 9 пациенток (7,8%) после операции ЦОК стали идентифицироваться в обогащенных образцах венозной крови (таблица 3).

Таблица 3

Динамика изменения частоты идентификации мРНК BIRC5 положительных и мРНК HER2-neu положительных ЦОК на этапе хирургического лечения (n=162)

Частота идентификации ЦОК
До операции		После операции
Наличие мРНК BIRC5 + мРНК HER2-neu + ЦОК		мРНК BIRC5 + мРНК HER2-neu + ЦОК исчезли		мРНК BIRC5 + мРНК HER2-neu + ЦОК сохранились		мРНК BIRC5 + мРНК HER2-neu + ЦОК появились
абс	%	абс	%	абс	%	абс	%
115	71,0%	47	40,9%	59	51,3%	9	7,8%

Было установлено, что от объема хирургической операции динамика изменения частоты идентификации BIRC5 положительных и мРНК HER2-neu положительных ЦОК имеет определенные закономерности. Так, после радикальной мастэктомии по Маддену, частота сохранения ЦОК была достоверно ниже, чем после радикальной резекции молочной железы и составила 46,9% против 61,8% (р=0,039) (таблица 4).

При анализе количества экспрессируемых таргетных генов в ЦОК после операции в сравнении с данными, полученными до начала специального лечения при исследовании периферической крови пациенток с верифицированным первичным неметастатическим РМЖ, была получена достоверная разница. Так, имело место статистически значимое снижение частоты одновременной экспрессии двух генов с 72,1% до 29,4%, с одновременным увеличением частоты идентификации ЦОК по одному из генов BIRC5 или HER2-neu (таблица 5).

Таблица 4

Динамика изменения частоты идентификации мРНК BIRC5 положительных и мРНК HER2-neu положительных ЦОК в зависимости от объема оперативного вмешательства метастатического поражения регионарных лимфатических узлов и их количества, а также выставленного опухолевого процесса (pTNM) были получены следующие данные.

Таблица 6

Объем операции	n	Частота идентификации ЦОК
		До операции		После операции
		Наличие BIRC5 + HER2-neu + ЦОК		BIRC5 + HER2-neu + ЦОК исчезли		BIRC5 + HER2-neu + ЦОК сохранились		BIRC5 + HER2-neu + ЦОК появились
		абс	%	абс	%	абс	%	абс	%
Радикальная мастэктомия по Маддену	113	81	71,7	35	43,2	38	46,9	8	9,9
Радикальная
резекция	49	34	69,4	12	35,3	21	61,8	1	2,9
p				0,283		0,105		0,204

Таблица 5

Количество экспрессируемых генов в ЦОК, обогащенных и выделенных у пациенток до оперативного вмешательства и сохранившихся после операции (n=68)

Количество экспрессируемых генов	Частота идентификации экспресси генов BIRC5 и Her2				р
	До операции		После операции
	абс	%	абс	%
2 гена	49	72,1%	20	29,4%	0,0000
1 ген BIRC5	6	8,8%	25	36,8%	0,0001
1 ген HER2-neu	13	19,1%	23	33,8%	0,0397

При качественном анализе уровней нормализованной экспрессии таргетных генов в ЦОК на этапе хирургического лечения достоверных различий в уровне экспрессии не было установлено (таблица 6).

При сравнительном анализе частоты сохранения мРНК BIRC5 положительных и мРНК HER2-neu положительных ЦОК в обогащенных образцах периферической крови пациенток до и после оперативного вмешательства в зависимости от размера первичной опухоли, наличия или отсутствия

Показатели нормализованной экспрессии таргетных генов, определяемых в ЦОК методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени (n=68)

Генетический маркер ЦОК	Время определения	Показатели нормализованной экспрессии генов BIRC5 и Her2					р
		Медиана	Мин	Макс	LQ	UQ
BIRC5	До операции	0,144	0,001	10,7	0,006	0,455	0,209
	После операции	0,387	0,001	8,72	0,113	1,053
HER2-neu	До операции	0,258	0,021	17,44	0,121	1,327	0,614
	После операции	0,207	0,258	9,09	0,111	0,830

Несмотря на то, что достоверных изменений частоты сохранения и обнаружения мРНК BIRC5 и мРНК HER2-neu положительных ЦОК после операции в зависимости от размера первичной опухоли (T) и поражения регионарных лимфатических узлов (N) не было установлено, суммарная оценка этих показателей, которая выражается в стадии опухолевого процесса была достоверной (таблица 7). Как это ни парадоксально, но частота сохранения таргетных ЦОК после операции при ранних стадиях (I–IIA) без поражения регионарных лимфоузлов была статистически значимо (p<0,05) выше и составила 66,2%, чем после операций по поводу местно-рас-простарненного опухолевого процесса (IIB–IIIC), где данный показатель составил 45,0%.

Таблица 7

Частота минимальной остаточной болезни на этапе хирургического лечения в зависимости от стадии опухолевого процесса

Категория значение		n	Частота идентификации ЦОК					p
			BIRC5 и Her2-neu+ ЦОК до операции		BIRC5 и Her2-neu + ЦОК после операции
			абс., n1	% от n	абс., n2	% от n1	% от n2
n		162	115	71,0	68	42,0	59,1
T	1	87	60	69,0	40	46,0	66,7	0,632 (n1-n2)
	2–4	75	55	73,3	28	37,3	50,9	0,171 (n-n2)
N	0	78	50	64,1	31	39,7	62,0	0,360 (n1-n2)
	1–3	84	65	77,4	37	44,0	56,9	0,346 (n-n2)
Стадия	I–IIA	108	74	68,5	49	45,4	66,2	0,023 (n1-n2)
	IIB–IIIC	54	40	74,1	18	33,3	45,0	0,096 (n-n2)

Примечание: n1 – абсолютное количество мРНК BIRC5 и мРНК Her2-neu положительных ЦОК случаев до операции, n2 – абсолютное количество мРНК BIRC5 и мРНК Her2-neu положительных ЦОК случаев после операции

Данный факт можно объяснить возможным уменьшением объема операции при ранних стадиях до радиальной резекции (квадрантэктомия, лампэктомия) и возможным вариантом сохранения опухолевых клеток в пределах оставшейся части молочной железы, являющихся источником ЦОК.

При сравнительном анализе частоты сохранения мРНК BIRC5 положительных и мРНК HER2-neu положительных ЦОК в обогащенных образцах периферической крови пациенток до и после оперативного вмешательства в зависимости от патоморфологических и молекулярно-биологических характеристик опухоли были получены следующие данные. Так, например, частота сохранения ЦОК в организме женщины после операции достоверно не завесила от гистологического строения первичной опухоли. Однако, данный показатель зависел от степени дифференцировки опухоли. Частота идентификации ЦОК после операции была на 10,3% выше при низкой степени дифференцировки (G3), чем при высоко дифференцированных опухолях (G1), и составили 60,3% и 50% соответственно (р=0,029). Статистически значимых отличий не было установлено в частоте наличия ЦОК после радикального хирургического лечения в зависимости от наличия или отсутствия опухолевой лимфососудистой стромальной инвазии (LVSI).

Важным моментом в данном фрагменте исследования является факт того, что частота обнаружения мРНК BIRC5 положительных и мРНК HER2-neu положительных ЦОК в обогащенных образцах периферической крови пациенток после радикальной мастэктомии или радикальной резекции достоверно зависит от молекулярно-биологического подтипа опухоли.

Достоверное изменение частоты идентификации ЦОК в сторону уменьшения после операции установлено при люминальном А и люминальном Б HER2 неэкспрессирующих раках (таблица 8).

Таблица 8

Частота минимальной остаточной болезни на этапе хирургического лечения в зависимости от молекулярно-биологического подтипа первичной опухоли

Молеку-лярно-био-логический подтип опухоли	n	Частота идентификации ЦОК					p
		BIRC5 и Her2-neu + ЦОК до операции		BIRC5 и Her2-neu + ЦОК после операции
		абс., n1	% от n	абс., n2	% от n1	% от n2
	162	115	71,0	68	42,0	59,1
Люминальный А	79	57	72,2	32	40,5	56,1	0,000
Люминальный Б HER2-	41	29	70,7	18	43,9	62,1	0,012
Люминальный Б HER2+	9	6	66,7	4	44,4	66,7	0,319
Гипер HER2 экс-прессиру-ющий	11	7	63,6	4	36,4	57,1	0,197
Трижды негативный	22	16	72,7	10	45,5	62,5	0,062

Примечание: n1 – абсолютное количество мРНК BIRC5 и мРНК Her2-neu положительных ЦОК случаев до операции, n2 – абсолютное количество мРНК BIRC5 и мРНК Her2-neu положительных ЦОК случаев после операции

При других молекулярно-биологических подтипах РМЖ достоверного снижения частоты идентификации ЦОК по тар-гетным генам не обнаружено. Данная ситуация свидетельствует о возможном более благоприятном течении первых двух форм РМЖ и благотворном влиянии оперативного вмешательства.

Однако, при сравнительном анализе частоты сохранения ЦОК в периферической крови в зависимости от подтипа опухоли достоверных различий не получено.

Обсуждение результатов исследования

Еще в 1929 г. Я.В. Зильберберг, допуская возможность гематогенного распространения клеток РМЖ, придавал операции значение фактора, содействующего массивному поступлению опухолевых клеток в кровь, а Б.Т. Билынский в 1963 г. опубликовал данные о том, что местные рецидивы развиваются у 13,3% женщин, оперированных по поводу РМЖ, причем большинство рецидивов возникает на протяжении первых 2 лет после операции [6,7]. Специально проведенное исследование на животных позволило установить патогенетическую роль клеточного микроокружения при заживлении операционной раны в развитии локального рецидива опухоли, которое обусловлено привлечением опухолевых клеток, циркулирующих в периферической крови в место заживления раны [8].

В нашем исследовании с учетом данных о наличии функционально активных гетерогенных ЦОК в периферической крови до начала специального лечения и главным образом до операции, следует отметить, что не оперативное вмешательство приводит к массивному поступлению опухолевых клеток в кровь, а ранняя опухолевая диссеминация имеет место до начала хирургического этапа лечения. Напротив, радикальное хирургическое вмешательство достоверно снижает количество ЦОК в периферической крови, что было продемонстрировано в послеоперационном периоде.

Согласно литературным данным «массаж» опухоли приводит по меньшей мере к 10-кратному увеличению количества опухолевых клеток, покидающих первичный опухолевый узел, а хирургические манипуляции при опухолях молочной железы могут индуцировать ангиогенез и пролиферацию клеток, отдаленных «дремлющих» микрометастазов, особенно у молодых пациенток с наличием положительных лимфатических узлов [6,7,9,10,11,12].

Согласно полученным данным объем оперативного вмешательства влияет на частоту сохранения ЦОК в периферической крови. Но, как это ни парадоксально, после менее травматичной операции, такой как радикальная резекция, частота сохранения ЦОК была достоверно выше, чем после большой травматичной операции с большим повреждением тканей – радикальной мастэктомии по Маддену, при которой опухоль значительно больше подвергается «массажу».

Следует учитывать и феномен «сбрасывания» опухолевых клеток из первичного узла, который связывают с ангио- генезом в опухоли, сосудистой инвазией, размерами опухоли и ее пролиферативным потенциалом [3]. Установлено, что опухолевые клетки могут выходить из растущего опухолевого узла со скоростью, составляющей от нескольких тысяч до нескольких миллионов клеток в день на 1 г ткани [13].

Исследования показали, что сохранение и появление в периферическом кровеносном русле ЦОК экспрессирующих генов, антиапоптотического протеина и рецептора эпидермального фактора роста зависит от размеров опухоли, поражения регионарных лимфатических узлов. Важным фактом является установление закономерности частоты выявления ЦОК от молекулярно-биологического подтипа первичной опухоли, который связан как с экспрессией рецепторов эстрогена и прогестерона, так и с экспрессией онкопротеина HER2-neu и индексом пролиферативной активности Ki-67.

Несмотря на то, что большинство опухолей может быть подвергнуто радикальному хирургическому вмешательству, так называемой резекции R0, у значительного количества пациентов через определенное время появляются отдаленные метастазы. Причиной этого является пред- или послеоперационная диссеминация опухолевых клеток, которые не были выявлены ко времени выполнения хирургической операции [14]. Свыше 20 лет назад такие клетки, или их кластеры, получили название микрометастазов и были включены в систему TNM 6-й редакции (2002) и оставлены в 7-й (2009), получив следующие обозначения по категории рМ: изолированные опухолевые клетки, найденные в костном мозге с помощью гистологических методов, – М0(i+); с помощью негистологических (иными словами, молекулярных) методов – M0 (mol+) [15]. Фактически эти клетки называются изолированными или диссеминированными в зависимости от нахождения их в крови или костном мозге; присутствие же таких клеток в организме онкологического пациента расценивается как МОБ.

С учетом данной классификации большинству пациенток может быть выставлена стадия M0 (mol+), а именно, с учетом полученных данных, у 71,0% до операции и у 42,0% после операции.

Выводы

Определение экспрессии гена сурвивина BIRC5 и гена рецептора эпидермального фактора роста HER2-neu в обогащенном образце периферической крови является достоверным идентификатором ЦОК и маркером МОБ.

Ранняя диссеминация опухолевых клеток при первичном неметастатическом РМЖ, подтверждаемая наличием мРНК BIRC5 и мРНК HER2-neu положительными ЦОК в 71%, способствует сохранению ЦОК в периферической крови до 51,3% пациенток, не смотря на проведенное хирургическое вмешательство. В ряде случаев оперативное вмешательство способствует выходу новых опухолевых клеток в периферический кровоток (7,8%).

Объем операции влияет на сохранения ЦОК в периферической крови. После радикальной мастэктомии по Маддену частота сохранения ЦОК была достоверно ниже, чем после радикальной резекции молочной железы и составила 46,9% против 61,8% (р=0,039).

Способствующими факторами для сохранения функционально активных ЦОК, экпрессирующих опухолеспецифические гены, кодирующие антиапоптотический пептид сур-вивин и рецептор эпидермального фактора роста, которые обеспечивают агрессивный фенотип этих клеток, являющихся источником метастазов, являются стадия опухолевого процесса, причем при ранних стадиях частота обнаружения ЦОК достоверно выше и составляет 45,4% при I–IIА и 33,3% при IIB–IIIC соответственно (р=0,023). Достоверно снижается частота таргентных ЦОК при люминальном А и люминальном Б не экспрессирующим HER2-neu подтипах РМЖ с 72,2% до 40,5% (р=0,000) и с 70,7% до 43,9% (р=0,012) соответственно. Частота сохранения ЦОК в периферической крови после операции не зависит от молекулярно-биологического подтипа первичной карциномы молочной железы.

Работа выполнялась в соответствии с планом научных исследований УО «Витебский государственный медицинский университет».