Экспрессия цитокератинов в опухолях щитовидной железы

Проблема диагностики злокачественных новообразований щитовидной железы (ЩЖ) связана не только и не столько с морфологическими и клиническими особенностями самих опухолей, сколько с недостаточным знанием биологической сущности новообразований. В последние годы предприняты попытки использования современных методов иммуногистохимии и молекулярной биологии для раскрытия молекулярногенетических механизмов развития опухолей, уточнения их злокачественности и оценки прогноза [1–11].

С целью решения проблем дифференциальной диагностики эффективным считается определение цитокератинов (cytokeratins – СК). Термин «цитокератин» был введен в конце 1970-х годов, когда были идентифицированы белки, из которых построены внутриклеточные промежуточные филаменты [12–13]. Определено более 20 различных СК, отличающихся по аминокислотному составу, молекулярному весу и изоэлектрической точке. Для разных типов эпителия характерны определенные группы СК [14]. Фолликулярный эпителий, относящийся к простым однослойных, всегда содержит СК7, 8, 18 и 19. Те же СК находят в эпителии всех типов доброкаче- ственных и злокачественных новообразований ЩЖ [15–17]. В папиллярных карциномах в местах плоскоклеточной метаплазии находят СК1, 5, 6, 13, характерные для многослойного плоского эпителия. Эти же СК присутствуют в трабекулярных гиалинизированных аденомах [18].

Известно также, что малигнизации эпителиальных клеток может приводить к изменению спектра СК, присущего эпителию определенной локализации [19]. Этот феномен мог бы быть использован в качестве маркера малигнизации. Учитывая это, разными группами исследователей изучался состав СК нормального тиреоидного эпителия по сравнению с эпителием доброкачественных и злокачественных новообразований ЩЖ. В результате исследований получены данные о исключительной экспрессии СК19 в фолликулярном эпителии 92% папиллярных карцином и 3% доброкачественных новообразований [20]. На этом основании сделан вывод о высокой эффективности использования СК19 в качестве маркера папиллярных карцином [21]. Между тем, существуют противоположные данные. Так, в фундаментальном исследовании Dockhorn-Dworniczak B. и соавторов обнаружено, что экспрессия СК19 с высокой частотой проявляется как в кар- циномах, так и в доброкачественных новообразованиях ЩЖ [22]. Другие исследователи наблюдали СК19 в эпителии нормальной ЩЖ, в 100% папиллярных карцином, 50% фолликулярных аденом, 72,7% гиперпластических узловых зобов и аутоиммунного тиреоидита.

Целью данного исследования было определение экспрессии цитокератинов иного спектра (СК7, 20, 34βЕ12) в качестве критериев дифференциальной диагностики фолликулярных неоплазий ЩЖ.

Материалы и методы

Для исследования экспрессии СК в фолликулярных неоплазиях ЩЖ определялись СК7 (призматический эпителий) (клон ВА4, DakoCytomation), СК20 (клон ВА17, DakoCytomation) и СК высокой молекулярной массы как показательных маркеров с моноклональным антителом 34βЕ12 (СК1, 5, 10 и 14 ) (клон 34βЕ12, DakoCytomation).

Иммуногистохимическому исследованию подлежали 24 препарата тиреоидных фолликулярных аденом, 16 препаратов фолликулярного рака ЩЖ (ФРЩЖ), 19 препаратов папиллярного рака щитовидной железы (ПРЩЖ).

Срезы толщиной 4–5 мкм наносили на предметные стекла, предварительно обработанные адгезивной жидкостью (poly-L-lysine) с последующей депарафинизацией в соответствии c принятыми стандартами. Для каждого маркера выполнялись контрольные исследования с целью исключения ошибочно положительного или ложноотрицательного результата. Дальнейшую обработку проводили с использованием систем визуализации LSAB2 и LabVision (UltraOne) в течение 10 минут с каждым реагентом с промежуточным промывкой в Трис-буферном растворе. После этого проводили реакцию с хромогеном DAB (DakoCytomation), микроскопически оценивая качество взаимодействия на протяжении от 20 сек. до 3 мин. Для дифференцировки структур тканей срезы дополнительно окрашивались гематоксилином Майера в течение 3 мин. Дегидратация и заливка в бальзам осуществлялись согласно известным принципам. Результат оценивали как положительный при выпадении солей хромогена именно в опухолевых клетках, причем в виде специфической реакции (мембранной или реакции цитоплазмы). Клетки, которые были положительными относительно экспрессии маркеров, изучались как минимум на 4–6 случайно выбранных полях зрения с использованием объективов ×10 и ×40. После подсчета 300 гистологически идентифицированных объектов (ядер или клеток), вычисляли показатели экспрессии по результатам всех изученных участков. Учитывалась положительная реакция в нормальных и опухолевых клетках фолликулярного тиреоидного эпителия.

Оценка иммуногистохимической реакции основывалась на интенсивности окраски и распределении имунопозитивних клеток по шкале: «-» – нет экспрессии, «+» – слабая экспрессия, «+ +» – умеренная экспрессия, и «+ + +» – интенсивное окрашивание.

Результаты исследования

В фолликулярных аденомах ЩЖ наблюдалась умеренная локусная экспрессия только на СК7 (20 случаев; 83,3%) (рис. 1). СК20 слабо экспрессировался в отдельных локусах опухолевой ткани (6 случаев; 25,0%) (рис. 2). Антитела к высокомолекулярным цитокератинам (клон 34βЕ12) не экспрессировались ни в одном из исследуемых случаев фолликулярных аденом ЩЖ.

Изучалось присутствие низкомолекулярного СК7 в материале ФРЩЖ. Антитела к СК7 реагировали в 100% представленных случаев, однако, с разной степенью интенсивности: от слабоположительной локальной реакции до умеренного диффузного окрашивания опухолевой ткани. Что касается цитокератинов высокой молекулярной массы (СК20 и клон 34βЕ12), то в исследованных случаях экспрессия данных маркеров отсутствовала, что соответствует имеющимся литературным данным.

При исследовании ПРЩЖ как обычного типа, так и его фолликулярного варианта, выявлено, что 94,7% случаев папиллярной карциномы, включая фолликулярный вариант, были положительны на СК20 (рис. 3). Интенсивность окрашивания колебалась от умеренной до ярко-выраженной, но во всех случаях определялась равномерная экспрессия во всей опухолевой ткани.

Таблица

Частота и выраженность экспрессии цитокератинов 7, 20 и 34βЕ12 в опухолях щитовидной железы

Иммуногистохимический маркер	Аденомы, n=24			Фолликулярный рак, n=16			Папиллярный рак, n=19
	Выраженность экспрессии	абс. количество	%	Выраженность экспрессии	абс. количество	%	Выраженность экспрессии	абс. количество	%
СК7	++	20	83,33	++	16	100,00	-	0	0,00
СК20	+	6	25,00	—	0	0,00	++	18	94,74
СК34βЕ12	—	0	0	—	0	0,00	+	17	89,47

Примечание: «—» – нет экспрессии; «+» – слабая экспрессия; «++» – умеренная экспрессия; «+++» – интенсивное окрашивание.

Рис. 1. Микрофолликулярная аденома. Умеренная позитивная цитоплазматическая реакция на СК7. ИГХ метод, дополнительное окрашивание гематоксилином Майера, ×400

Рис. 4. Умеренная экспрессия высокомолекулярных цито-кератинов (клон 34βE12) в фолликулярном варианте папиллярного рака. ИГХ метод, дополнительное окрашивание гематоксилином Майера, ×400

Рис. 2. Микрофолликулярная аденома. Незначительная позитивная цитоплазматическая реакция на СК20. ИГХ метод, дополнительное окрашивание гематоксилином Майера, ×400

Рис. 3. Папиллярная карцинома. Умеренная позитивная цитоплазматическая реакция на СК20. ИГХ метод, дополнительное окрашивание гематоксилином Майера, ×400

При определении присутствия высокомолекулярных СК34βЕ12 обнаружено, что антитела реагировали с 89,5% ПРЩЖ, включая его фолликулярный вариант. В целом, участки окрашивания в ПРЩЖ были выраженными и равномерными (рис. 4).

Таким образом, данные по экспрессии СК7, 20 и 34βЕ12 предоставляют возможность подтвердить гипотезу о наличии уникального спектра цитокератинов для каждой из опухолевых форм патологии фолликулярного эпителия ЩЖ, что может быть полезным для дифференциальной диагностики тиреоидных неоплазий.

Выводы

• 1.    Для фолликулярных аденом ЩЖ характерной была экспрессия СК7 (83,33%) и отсутствие экспрессии СК34βЕ12.

• 2.    Препараты фолликулярного рака ЩЖ экспрессировали СК7 в 100% случаев. СК20 и СК34βЕ12 не определялись ни в одном из препаратов.

• 3.    Отсутствие экспрессии СК7, высокая частота определения СК20 и СК34βЕ12 (89,47–94,74%) была характерной для папиллярного рака ЩЖ.

• 4.    Сопоставление полученных данных может быть полезным для дифференциальной диагностики фолликулярных неоплазий.