Экспрессия генов цитокинов, ассоциированных с опухолевыми и преметастатическими нишами, в строме рака молочной железы

Метастазирование опухоли остается одной из основных причин смертности от рака молочной железы. В настоящее время ведутся исследования, направленные на поиск механизмов, лежащих в основе этого процесса. Сформулировано несколько концепций метастазирования. Наиболее значимые из них: теория «механического ареста» [1], предложенная J. Ewing в начале XX века, и теория S. Paget – «семян и почвы» [2], выводящая на первый план роль микроокружения в образовании вторичной опухоли в органах-мишенях. В продолжение последней Д. Лайденом (2005) была разработана концепция преметастатических ниш [3]. Показано, что в первичной опухоли параллельно с формированием преметастатической ниши происходит формировании ниши, называемой опухолевой. Биологическим смыслом ее создания является обеспечение оптимальных условий для роста первичной опухоли. Ключевым процессом образования как опухолевой, так и преметастати-ческой ниши является рекрутирование из костного мозга клеток-предшественников, инфильтрация иммунными клетками, секретирующими цитокины [3]. Таким образом, опухолевая ниша может

являться отражением событий, происходящих в преметастатической нише. В нашем исследовании на основании оценки экспрессии генов, имеющих отношение к формированию опухолевых ниш клетками, составляющими микроокружение опухоли, мы попытались охарактеризовать вклад последних в создание благоприятных условий для премета-статических ниш.

Материал и методы

В исследование вошли 12 пациенток, проходивших лечение в НИИ онкологии Томского НИМЦ в период с 2012 по 2015 г., с верифицированным диагнозом инвазивная карцинома молочной железы неспецифического типа (IC NST). Всем больным было выполнено хирургическое вмешательство в объеме секторальной резекции или радикальной мастэктомии с аксиллярной лимфо-диссекцией (табл. 1). Предоперационного лечения не проводилось.

В исследуемой группе оценивались основные клинико-патологические параметры: размер опухоли, принадлежность к определенному молекулярно-генетическому подтипу, выраженность воспалительной реакции в строме, выраженность фиброза и гиалиноза, вовлеченность лимфатических узлов и наличие гематогенных метастазов. Выраженность фиброза и гиалиноза оценивалась по 3-балльной шкале, где 1 балл – нет или слабо, 2 – умеренно, 3 – выражен. Исследование проводилось при информированном согласии всех включенных пациентов, разрешение получено в локальном этическом комитете (№ 10 от 24.04.2015).

С помощью технологии лазерной микродиссекции PALM (Carl Zeiss, Германия) из образцов свежего нефиксированного материала опухоли было получено микроокружение, из которого в дальнейшем была выделена РНК согласно адаптированному протоколу RNeasy Plus Micro Kit (Qiagen, USA). Обратная транскрипция и полнотранскриптомная амплификация были проведены с использованием набора QuantiTect Whole Transcriptome Kit (Qiagen, USA). С помощью метода полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием технологии TaqMan была оценена экспрессия генов CCL2 (MCP-1), CXCL12 (SDF-1), MSP, MIF, IL-1b, IL-6, IL-8, TNFa, FGF, EGF, VEGF, TGFb1, IGF относительно гена рефери – ACTB. Последовательности специфических праймеров и проб представлены в табл. 2.

Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения SPSS 11.0 (SPSS, Chicago, USA). Для каждой выборки вычисляли средневыборочные характеристики. Проверку нормальности распределения количественных показателей проводили с использованием критерия Шапиро – Уилка. Сравнение частот встречаемости проводили с помощью точного критерия Фишера. Для оценки достоверности различий независимых выборок использовали критерий Манна – Уитни. Наличие корреляций определяли с помощью критерия Спирмана. Построение математической модели осуществляли с помощью логистической таблица 1

характеристика больных инвазивной карциномой неспецифического типа молочной железы

Параметр Возраст, лет Значения параметров 52,8 ± 9,5 Частота встречаемости I 3 (25,0 %) Стадия II 7 (58,3 %) III 2 (16,7 %) Размер опухоли Менее 2 см 2–5 см 2 (16,7 %) 10 (83,3 %) Люминальный А 2 (16,7 %) Молекулярно-генетический тип Люминальный В 8 (66,7 %) Трижды негативный 2 (16,7 %) Рецепторы эстрогенов Позитивно Негативно 10 (83,3 %) 2 (16,7 %) Рецепторы прогестерона Позитивно Негативно 10 (83,3 %) 2 (16,7 %) HER2/neu Позитивно Негативно - 12 (100 %) Ki67 Экспрессия <20 % 2 (16,7 %) Экспрессия >20 % 10 (83,3 %) Лимфогенные метастазы Есть Нет 5 (41,7 %) 7 (58,3 %) Гематогенные метастазы Есть Нет 1 (8,3 %) 11 (91,7 %) таблица 2

Последовательность специфических праймеров и проб

Гены Полное название/синоним Праймеры и проба (5'-3') CCL2 Monocyte Chemotactic Protein 1 F GCAAGTGTCCCAAAGAAGC R GTGAGTGTTCAAGTCTTCGG CXCL12 Stromal Cell-Derived Factor 1 PROBE CAAGGAGATCTGTGCTGACCCCAA F GCATTGACCCGAAGCTAAAG R GCCCTTCCCTAACACTGG MST1 Macrophage-Stimulating Protein PROBE GTCTGACCCTCTCACATCTTGAACC F CCCCTGAATGGTATGTGGT R CCTCGGTGCTTGATGTTAC MIF Macrophage Migration Inhibitory Factor PROBE TGTGGCCTTGCTGAATGTCATCTCC F GCAGAACCGCTCCTACAG R CTTAGGCGAAGGTGGAGTTG IL-1b Interleukin 1 Beta PROBE TAGTTGATGTAGACCCTGTCCGGGC F CTCTTCAGCCAATCTTCATTGC R AGGAGCACTTCATCTGTTTAGG IL-6 Interleukin 6 PROBE ACCTGAGCTCGCCAGTGAAATGAT F CAACCTGAACCTTCCAAAGATG R ACCTCAAACTCCAAAAGACCAG CXCL8 Interleukin 8 / Granulocyte Chemotactic Protein 1 Tumor Necrosis Factor PROBE CCAGGCAAGTCTCCTCATTGAATCC F CCACCCCAAATTTATCAAAGAACTG R AAACTTCTCCACAACCCTCTG TNF PROBE CCACACTGCGCCAACACAGAAA F TCTATCTGGGAGGGGTCTTC R TCCCAAAGTAGACCTGCCC FGF7 Fibroblast Growth Factor 7 PROBE GCTGGAGAAGGGTGACCGACT F GGTACCTGAGGATCGATAAAAGAG R CACTTTCCACCCCTTTGATTG EGF Epidermal Growth Factor PROBE ACTGCCACTGTCCTGATTTCCATGA F AGCAGTTGATCCAGTAGAAAGG R CAAGCACATCCAATGACACAG VEGFA Vascular EndothelialGrowth Factor A PROBE AGCCTTCACTCCCACACCATCG F CAGATTATGCGGATCAAACCT R GCTCTATCTTTCTTTGGTCTGC TGFb1 Transforming Growth Factor Beta 1 PROBE GCCAGCACATAGGAGAGATGAGC F CCACCCCGCTGGAGAGG R GCCGCACGCAGCAGTTC IGF1 Insulin Like Growth Factor 1 PROBE ACCAACTATTGCTTCAGCTCCACGG F AGGCTGGAGATGTATTGCG R TCCTGTAGTTCTTGTTTCCTGC ACTB Beta-Actin PROBE TTCCTTCTGGGTCTTGGGCATGT F GAGAAGATGACCCAGATCATGTT R ATAGCACAGCCTGGATAGC PROBE AGACCTTCAACACCCCAGCCAT регрессии. Различия считались достоверными при уровне значимости р<0,05.

Результаты и обсуждение

Известно, что опухоль способна формировать свое микроокружение посредством секреции различных факторов, которое в дальнейшем будет опосредовать инвазивные и метастатические свойства трансформированных клеток. Формирование опухолевой ниши с высокой вероятностью происходит параллельно с преметастатическими нишами. В силу отсутствия инструментов для обнаружения формирующейся преметастатической ниши оценить профиль экспрессии цитокинов в ней невозможно. Исследование опухолевой ниши позволяет приблизиться к пониманию событий, которые могли бы происходить в местах будущих метастазов.

Была оценена выраженность воспалительной реакции в строме в соответствии с рекомендациями международной рабочей группы [4], выраженности фиброза и гиалиноза стромы. В 36,4 % (4/11)

таблица 3

Частота и уровень экспрессии генов, вовлеченных в формирование преметастатической ниши

Ген Частота экспрессии Уровень экспрессии (усл. ед.) CCL2 5 (41,7 %) 0,024 (0,003–0,429) CXCL12 10 (83,3 %) 0,040 (0,006–5,353) MST1 0 (0 %) – MIF 11 (91,7 %) 0,137 (0,065–4,528) IL-1b 8 (66,7 %) 0,006 (0,000–3,797) IL-6 8 (66,7 %) 0,053 (0,005–0,868) CXCL8 12 (100 %) 0,034 (0,001–2,007) TNF 0 (0 %) – FGF7 0 (0 %) – EGF 0 (0 %) – VEGFA 2 (16,7 %) 0,004 (0,001–0,005) TGFb1 6 (50,0 %) 0,064 (0,006–1,139) IGF 3 (25,0 %) 0,015 (0,005–0,188) случаев выраженность инфильтрации стромы лимфоцитами составила 1 % от площади стромы, в 9,1 % (1/11) – 5 %, в 27,3 % (3/11) – 10 % и в 27,3 % (3/11) – 20 %. Стоит отметить, что выраженность воспалительной реакции в строме увеличивалась со стадией заболевания (r=0,619; p=0,042). Фиброз стромы в 36,4 % (4/11) случаев был оценен на 1 балл, в 63,6 % – в 2 балла. Среди изученных опухолей гиалиноз стромы был выражен слабо или отсутствовал (90,9 %).

Была оценена частота экспрессии клетками микроокружения генов, ассоциированных с формированием опухолевых и преметастатических ниш (табл. 3). Микроокружение опухоли (опухолевая ниша) в зависимости от клеточного состава и цитокиновой активности может приводить к противоположным эффектам: стимулировать или ингибировать пролиферативную активность, инвазивные и метастатические потенции опухолевых клеток. Практически всегда в микроокружении IC NST обнаруживалась экспрессия генов CXCL8, CXCL12, MIF и примерно в половине случаев – CCL2, IL-1b, IL-6, TGFb1 . Перечисленные гены кодируют цитокины, обладающие свойствами хемоаттрактантов, про- и противовоспалительными функциями [5]. Однако связанными со свойствами первичной опухоли оказались лишь некоторые. В проведенном исследовании была показана прямая корреляция между величиной опухолевого узла и уровнем экспрессии генов IL1b (r=0,783; p=0,022) и CXCL8 (кодирует белок IL8) (r=0,580; p=0,048). IL1b является ключевым в развитии острой фазы воспаления, в частности повышает проницаемость сосудов, а IL8 привлекает в очаг воспаления гранулоциты [5].

Можно полагать, что обнаруженная экспрессия генов цитокинов провоспалительного спектра в микроокружении опухоли через привлечение клеток-предшественников и лейкоцитов вызывает в конечном итоге промоторный или ингибиторный эффект. Интересно, что пролиферативная актив- ность опухолевых элементов, которая, как правило, сопряжена с величиной опухоли, имела обратную корреляцию с экспрессией гена хемокина CCL2, привлекающего моноциты (r=0,900; p=0,037). С другой стороны, выявлена прямая корреляционная связь между экспрессией генов IL1b и IL6, IL8 и фактором, иммобилизующим макрофаги (MIF) (соответственно r=0,893; p=0,007; r=0,964; p=0,000; r=0,909; p=0,000).

Таким образом, высокий уровень экспрессии генов провоспалительных цитокинов связан с большей величиной опухоли, а низкий уровень экспрессии хемоаттрактанта для моноцитов связан с повышением пролиферативной активности опухоли. Можно полагать, что описываемые цитокины и характер взаимодействия между ними свойственны промоторной опухолевой нише.

В отличие от экспрессии генов цитокинов, имеющих отношение к росту первичной опухоли, экспрессии генов цитокинов, с которыми связаны инвазивные и метастатические свойства, не обнаружено в микроокружении опухоли. Оказалось, что в клетках, формирующих микроокружение инвазивной карциномы молочной железы неспецифического типа, отсутствует экспрессия генов TNF, MST1, FGF7, EGF. Последние три фактора являются активными участниками опухолевого прогрессирования. Так, известно, что связывание FGF-7 с рецептором, который экспрессирован преимущественно на эпителиальных клетках, но не фибробластах [6], опосредует миграцию и инвазию опухолевых клеток. EGF, связываясь с рецептором, стимулирует метастазирование опухолевых клеток [7], а MSP промотирует развитие метастазов [8]. TNF известен своими противоопухолевыми эффектами, тем не менее существуют работы, показывающие его роль в промотировании опухолевого роста [9]. Стоит отметить, что экспрессия указанных факторов отсутствовала и в группе пациентов с наличием лимфогенных метастазов. Это позволяет предположить, что их источником, возможно, являются не клетки микроокружения, а сами опухолевые элементы. Вместе с тем в микроокружении опухоли обнаружена экспрессия генов IL6 и IL8, которая позволяет предполагать, что привлекаемые в строму благодаря эффектам CCL2 моноциты с высокой вероятностью дифференцируются в М2 макрофаги, способствующие формированию инвазивного фенотипа опухолевых клеток.

В проведенном исследовании не было обнаружено достоверных различий в частоте встречаемости и уровне экспрессии всех изучаемых генов в группах пациентов с наличием и отсутствием лимфогенных метастазов. Тем не менее использование многофакторного метода обработки данных (метода логистической регрессии) позволило выявить комплекс взаимоотношений между изучаемыми параметрами, который связан с высоким риском развития лимфогенных метастазов у пациенток с инвазивной карциномой неспецифического типа молочной железы, не получавших неоадъювантной терапии. В математическую модель вошли такие переменные, как выраженность воспалительной