Экспрессия генов множественной лекарственной устойчивости и монорезистентности при немелкоклеточном раке легкого

СИБИРСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2014. № 1 (61)

В большинстве развитых стран рак легкого является наиболее распространенной формой злокачественного новообразования. В России ежегодно диагностируется более 52 тыс. новых случаев (86,7 на 100 тыс. населения), при этом выявляемость больных с I–II стадиями составляет 26,4 %, с III и IV стадиями – 31,8 % и 38,3 % соответственно [2, 8, 17].

Несмотря на постоянное совершенствование хирургического метода, заметной тенденции к улучшению показателей выживаемости за последние годы не наблюдается. Обобщенные данные ряда клиник показывают, что после радикальных хирургических вмешательств 5-летняя выживаемость больных немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ) II стадии составляет в среднем 46 %, с IIIА–В стадиями не превышает 11–15 % [6, 11]. Таким образом, подтверждается необходимость использования системной терапии у данной категории пациентов. Химиотерапия в случаях резек-табельного рака легкого может применяться как до операции, так и после нее. При этом преимущества того или иного режима химиотерапии находятся в процессе изучения, и нет пока однозначной точки зрения в плане рекомендаций по ее применению в комбинированном лечении НМРЛ [1, 5, 7, 17].

Важнейшим ограничением конвенциональной химиотерапии рака является химиорезистентность, которая может быть как предсуществующей, так и формироваться в процессе лечения и обусловливаться повышением экспрессии энергозависимых транспортеров лекарств ( ABCB1 , ABCC1 , ABCC2 , ABCG1 , ABCG2 , MVP ), осуществляющих выброс цитостатических препаратов из опухолевых клеток против градиента концентрации [13].

Кроме этого, чувствительность опухоли к отдельным препаратам коррелирует с экспресси-онными характеристиками некоторых молекул, которые называют маркерами монорезистентности. Например, повышенная экспрессия ферментов репарации ДНК, в частности ERCC1 и ХRCC1, позволяет опухоли нейтрализовать воздействие препаратов платины и алкилирующих агентов [10]. Для таксанов и винорельбина важна экспрессия в опухоли β3-тубулина (TUBB3) – основного строительного материала микротрубочек, которые разрушают таксаны и винорельбин. При НМРЛ высокая экспрессия TUBB3 связана с хорошим ответом на адъювантную химиотерапию по схеме цисплатина и винорельбина [14]. Настоящее исследование посвящено изучению механизмов, участвующих в реализации эффекта неоадъювантной химиотерапии (НАХТ) немелкоклеточного рака легкого, которые связаны с экспрессией генов множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) и монорезистентности.

Цель исследования – изучить экспрессию генов МЛУ и монорезистентности в нормальной ткани бронхов и опухолевой ткани немелкоклеточного рака легкого после проведения неоадъювантной химиотерапии по схеме винорельбин/карбоплатин.

Материал и методы

В исследование включены 27 больных немелкоклеточным раком легкого Т2–4N0–3M0, получавших лечение в клиниках ФГБУ «НИИ онкологии» СО РАМН. Исследование проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией 1964 г. (исправленной в 1975 и 1983 гг.), получено разрешение локального этического комитета НИИ онкологии СО РАМН и информированное согласие пациентов. Пациенты получали комбинированное лечение: 2 курса НАХТ по схеме винорельбин (35 мг/м2) / карбоплатин (AUC 6), радикальное хирургическое вмешательство и 3 курса химиотерапии в адъювантном режиме по той же схеме.

Распределение больных по полу: мужчин – 23 (85,2 %), женщин – 4 (14,8 %). Медиана возраста – 57,8 года (диапазон 46–67 лет). Центральный рак выявлен у 15 (55,5 %) больных, периферический рак – у 12 (44,5 %). По морфологии плоскоклеточный рак выявлен у 18 (66,7 %) больных, реже встречалась аденокарцинома – у 7 (25,9 %), на долю карциносаркомы и крупноклеточного рака пришлось по 1 случаю (3,7 %). Стадии заболевания: IIА стадия была диагностирована у 3 (11,1 %) больных, IIB стадия – у 6 (22,2 %), IIIA стадия – у 15 (55,5 %) и IIIB стадия зафиксирована у 3 (11,1 %) пациентов. Объем выполненных операций: реконструктивнопластические – 4 (14,8 %) вмешательства, комбинированные операции – 6 (22,2 %), лобэктомии – 10 (37 %) и пневмонэктомии – 7 (25,9 %) случаев. Всем пациентам выполнялась медиастинальная лимфодиссекция.

Материалом для исследования служила нормальная ткань бронхов, нормальная ткань легких и опухолевая ткань, которые забирались во время оперативного вмешательства после курсов НАХТ. Образцы ткани (~60–70 мм3) помещали в раствор

Рис. 1. Экспрессия генов МЛУ и монорезистентности в опухолевой ткани легкого и нормальных бронхах после проведения НАХТ.

Примечание: * – различия между выборками статистически значимы

RNAlater (Ambion, USA) и сохраняли при температуре –80ºС (после 24-часовой инкубации при +4ºС) для дальнейшего выделения РНК. Тотальную РНК выделяли с помощью набора RNeasy mini kit Plus, содержащего ДНК-азу I (Qiagen, Germany) с добавлением в раствор РНК ингибитора РНК-аз Ribo-LockTM (Fermentas, Lithuania). RIN составил 6,6–8,0, определялся при помощи системы капиллярного электрофореза TapeStation (Agilent Technologies, USA). Концентрацию и чистоту выделения РНК оценивали на спектрофотометре NanoDrop-2000 (Thermo Scientific, USA) (концентрация РНК составила 75–210 нг/мкл, А260/А280=1,85–2,15; А260/ А230=1,80–2,22). Для получения кДНК на матрице РНК проводили реакцию обратной транскрипции с помощью набора RevertAid™ (Fermentas, Lithuania) со случайными гексануклеотидами. Уровень экспрессии генов 9 МЛУ: ABCB1, ABCB2, ABCC1, ABCC2, ABCС5, ABCG1, ABCG2, GSTP1, MVP, и 7 генов монорезистентности: BRCA1, ERCC1, RRM1, TOP1, TOP2A, TUBB3, TYMS оценивали при помощи обратнотранскриптазной количественной ПЦР в режиме реального времени (RT-qPCR) по технологии TaqMan на амплификаторе Rotor-Gene-6000 (Corbett Research, Australia). ПЦР ставили в объеме 15 мкл с 2,5 ед HotStart Taq polymerase (Sibenzyme, Россия) с соответствующим буфером и 50 нг кДНК. Последовательность праймеров представлена в табл. 1, методика оценки относительной экспрессии генов МЛУ описана ранее [9]. Для калибратора использовали РНК здоровой легочной ткани 10 больных НМРЛ. В качестве результата использовался уровень экспрессии указанных генов относительно GAPDH и нормальной ткани бронхов, вычисляемый по методу Pfaffl [12].

Статистическая обработка данных проводилась с использованием пакета прикладных программ «STATISTICA 8.0» (StatSoft Inc., USA). Для проверки гипотезы о значимости различий признака использовали критерий Вилкоксона – Манна – Уитни.

Результаты и обсуждение

После проведенного лечения эффективность НАХТ была оценена с помощью шкалы RECIST у 27 пациентов. Полная регрессия была достигнута в 1 (3,7 %), частичная регрессия – в 4 (14,8 %) случаях, а наиболее часто встречался эффект стабилизации процесса – в 22 (81,5 %) наблюдениях.

Было установлено, что в нормальных бронхах экспрессия генов: АВСВ1 , АВСВ2 , ABCG1 , ERCC1 , GSTP1 и MVP после проведения НАХТ значительно выше, чем в опухолевой ткани, за исключением гена TOP2a , экспрессия которого в опухоли выше, чем в бронхах (рис. 1), т. е. противоопухолевые химиопрепараты накапливаются больше в опухолевой ткани легких, а не в бронхах.

На следующем этапе оценили связь экспрессии генов МЛУ и монорезистентности с основными клинико-морфологическими параметрами. Не было установлено связи экспрессии изучаемых генов в опухоли с возрастом пациентов (данные не представлены) и лимфогенным метастазированием (табл. 2).

У больных с опухолью, соответствующей Т_3–4, отмечалась сниженная по сравнению с Т_1–2 экспрессия генов ABCG1 , ABCG2 и ERCC1 после НХТ, что может обусловливать более высокую чувствительность опухоли больных с Т_3–4 к химиотерапии и карбоплатину, в частности, поскольку известно, что высокая экспрессия генов репарации и ERCC1 определяет устойчивость опухоли легкого к препаратам платины (табл. 2) [16].

При периферической локализации опухоли экспрессия генов MVP и ТОР1 выше, чем при центральной локализации, в 2–3 раза (табл. 3). Аденокарцинома, по сравнению с плоскоклеточным раком, отличалась высокой экспрессией BRCA1 , определяющего резистентность к карбоплатину, и генов MVP и ABCB1 , которые отвечают за устойчивость к винорельбину [18]. Это может явиться одной из важных причин известной в литературе низкой чувствительности аденокарциномы (по

Таблица 1

Гены	Ампликон	Последовательность	Дизайн
ABCB1 NM_000927.4	93 bp	F 5'-gattgacagctacagcacgg-3'	ОД
		R 5’-ggtcgggtgggatagttga-3’
		Probe 5’-tgccgaacacattggaaggaaa-3’
ABCB2 NM_018833.2 NM_000544.3	153 bp	F 5’-ctggtcgtgtgattgacatcct-3’	[10]
		R 5’-gcaagttgattcgagacatggt-3’
		Probe 5’-aggtgattttgacccccatgccttt-3’
ABCC1 NM_004996.3	87 bp	F 5’-aggtgggctgcggaaag-3’	ОД
		R 5’-cggagcccttgatagcca-3’
		Probe 5’-tggctgagatggacaaagtggag-3’
ABCC2 NM_000392.3	85 bp	F 5’-cctgtcggctctgggaa-3’
		R 5’-tgcccttgatggtgatgtg-3’
		Probe 5’-ggactgctgtgggacatagg-3’
ABCC5 NM_005688.2	76 bp	F 5’-caagagggtaaactggttgga-3’
		R 5’-ctaaaatggctgaaatgagagag-3’
		Probe 5’-ggcagtgtgggaagtggaaaa-3’
ABCG1 NM_004915.3	78 bp	F 5’-cctactacctggccaagaccat-3'	[10]
		R 5’-agtacacgatgctgcagtaggc-3'
		Probe 5’-acgtgccctttcagatcatgttcccagt-3’
ABCG2 NM_004827.2	97 bp	F 5’-aaaggatgtctaagcaggga-3’	ОД
		R 5’-tgaggccaataaggtgagg-3’
		Probe 5’-tcgaggctgatgaatggagaag-3’
BRCA1 NM_007294.3 NM_007298.3 NM_007297.3 NM_007300.3	107 bp	F 5’- acagctgtgtggtgcttctgtg -3’
		R 5’- cattgtcctctgtccaggcatc -3’
		Probe 5’- catcattcacccttggcacaggtgt -3’
ERCC1 XM_005258638.1 Все транскрипты	121 bp	F 5’- ggcgacgtaattcccgacta -3’
		R 5’- agttcttccccaggctctgc -3’
		Probe 5’- accacaacctgcacccagactacatcca -3’
GAPDH NM_002046.3	124 bp	F 5’-gccagccgagccacatc-3’
		R 5’-ggcaacaatatccactttaccaga-3’
		Probe 5’-cgcccaatacgaccaaatccg-3’
GSTP1 NM_000852.3	84 bp	F 5’- ctggtggacatggtgaatgac -3'
		R 5’- cttgcccgcctcatagttg -3'
		Probe 5’- aggacctccgctgcaaatacatctc -3'
MVP NM_017458.3	87 bp	F 5’-ggaggtgctggaaaaggac-3’
		R 5’-tcctcaaaatcaagcagcg-3’
		Probe 5’-ctgcccaacactgccctccat-3’
RRM1 NM_001033.3	94 bp	F 5’- actaagcaccctgactatgctatcc -3’
		R 5’- cttccatcacatcactgaacacttt -3’
		Probe 5’- cagccaggatcgctgtctctaacttgca -3’

Последовательность праймеров и проб исследованных генов

Продолжение таблицы 1

TOP1 NM_003286.2	97 bp	F 5’-ggcgagtgaatctaaggataatgaa -3’	ОД
		R 5’- tggatatcttaaagggtacagcgaa -3’
		Probe 5’-accattttcccatcatcctttgttctgagc -3’
TOP2A NM_001067.3	75 bp	F 5’-agtcgctttcagggttcttgag-3’	ОД
		R 5’-tttcatttacaggctgcaatgg-3’
		Probe 5’-cccttcacgaccgtcaccatgga-3’
TUBB3 NM_006086.3	71 bp	F 5’-gggccaagttctgggaagtc-3’
		R 5’-cgagtcgcccacgtagttg-3’
		Probe 5’-atgagcatggcatcgaccccagc-3’
TYMS NM_001071.2	91 bp	F 5’-tctggaagggtgttttgga-3'
		R 5’-tcccagattttcactccctt-3'
		Probe 5’-tctttagcatttgtggatcccttga-3'

Примечание: все пробы – FAM →BHQ1; NM – номер последовательности РНК в NCBI Nucleotide Database ; bp – пары оснований; F – прямой праймер; R – обратный праймер; ОД – оригинальный дизайн.

Таблица 2

Гены	Размер опухоли		Лимфогенное метастазирование
	Т	Т	N 0	N1–3
ABCB1	0,40 ± 0,22	0,13 ± 0,05	0,25 ± 0,16	0,16 ± 0,06
ABCB2	0,33 ± 0,15	0,28 ± 0,07	0,30 ± 0,10	0,28 ± 0,08
ABCC1	0,98 ± 0,78	0,56 ± 0,15	0,80 ± 0,50	0,58 ± 0,17
ABCC2	0,07 ± 0,05	0,21 ± 0,06	0,26 ± 0,11	0,14 ± 0,06
ABCC5	0,65 ± 0,24	0,52 ± 0,11	0,59 ± 0,18	0,53 ± 0,12
ABCG1	0,42 ± 0,17*	0,17 ± 0,05	0,23 ± 0,13	0,23 ± 0,06
ABCG2	0,58 ± 0,36*	0,16 ± 0,06	0,24 ± 0,12	0,27 ± 0,13
BRCA1	0,10 ± 0,07	0,37 ± 0,13	0,46 ± 0,23	0,23 ± 0,11
ERCC1	0,37 ± 0,09*	0,13 ± 0,03	0,19 ± 0,08	0,18 ± 0,05
GSTP1	0,40 ± 0,20	0,40 ± 0,16	0,24 ± 0,16	0,49 ± 0,17
MVP	0,63 ± 0,21	0,42 ± 0,11	0,50 ± 0,17	0,45 ± 0,12
RRM1	0,17 ± 0,01	0,32 ± 0,11	0,14 ± 0,02	0,36 ± 0,12
TOP1	0,33 ± 0,19	0,21 ± 0,07	0,25 ± 0,13	0,23 ± 0,08
TOP2a	0,76 ± 0,25	2,46 ± 1,12	1,02 ± 0,63	2,61 ± 1,28
TYMS	0,25 ± 0,12	0,31 ± 0,08	0,38 ± 0,10	0,26 ± 0,08
TUBB3	0,51 ± 0,07	1,21 ± 0,43	1,27 ± 0,59	0,95 ± 0,43

Примечание: * – различия между выборками статистически значимы. СИБИРСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2014. № 1 (61)

Связь экспрессии генов МЛУ и монорезистентности в опухолевой ткани легкого с размером опухоли и лимфогенным метастазированием

Таблица 3

Гены	Гистотип		Локализация
	Аденокарцинома	Плоскоклеточный	Периферическая	Центральная
ABCB1	0,24 ± 0,09*	0,10 ± 0,03	0,26 ± 0,11	0,13 ± 0,05
ABCB2	0,33 ± 0,18	0,22 ± 0,06	0,36 ± 0,10	0,21 ± 0,07
ABCC1	0,12 ± 0,06	0,76 ± 0,31	0,54 ± 0,22	0,76 ± 0,33
ABCC2	0,25 ± 0,07	0,15 ± 0,07	0,12 ± 0,04	0,23 ± 0,09
ABCC5	0,25 ± 0,05	0,66 ± 0,15	0,39 ± 0,09	0,71 ± 0,16
ABCG1	0,17 ± 0,05	0,22 ± 0,07	0,25 ± 0,09	0,21 ± 0,07
ABCG2	0,13 ± 0,04	0,34 ± 0,17	0,31 ± 0,17	0,20 ± 0,08
BRCA1	0,64 ± 0,33*	0,17 ± 0,05	0,51 ± 0,23	0,16 ± 0,04
RRM1	0,28 ± 0,15	0,29 ± 0,13	0,28 ± 0,12	0,28 ± 0,13
GSTP1	0,13 ± 0,11	0,42 ± 0,19	0,29 ± 0,11	0,52 ± 0,23
MVP	1,09 ± 0,62*	0,30 ± 0,08	0,64 ± 0,12*	0,30 ± 0,13
ERCC1	0,13 ± 0,05	0,15 ± 0,05	0,25 ± 0,07	0,13 ± 0,04
TOP1	0,25 ± 0,22	0,14 ± 0,05	0,38 ± 0,12*	0,10 ± 0,04
TOP2a	0,38 ± 0,28*	3,28 ± 1,50	0,83 ± 0,21	3,34 ± 1,69
TYMS	0,37 ± 0,17	0,27 ± 0,09	0,34 ± 0,10	0,25 ± 0,09
TUBB3	2,21 ± 1,08*	0,87 ± 0,39	1,52 ± 0,58	0,59 ± 0,31

Примечание: * – различия между выборками статистически значимы.

сравнению с плоскоклеточным раком) к химиотерапии [5].

После проведения НАХТ была оценена экспрессия генов МЛУ и монорезистентности в опухолевой ткани у больных с частичной регрессией и стабилизацией. Статистически значимых различий не установлено, что связано с небольшой частотой больных с частичной регрессией (n=4). Однако на рис. 2 хорошо виден низкий уровень экспрессии большинства генов МЛУ и монорезистентности в опухоли легкого больных с частичной регрессией (для генов АВСВ1 , АВСВ2 , ABCC2 , ABCG1 , TYMS снижение на уровне тенденции, 0,05

Рис. 2. Экспрессия генов МЛУ и монорезистентности в опухолевой ткани легкого у больных с различным ответом на НАХТ

НАХТ сочеталось с хорошим ответом на лечение. Повышение экспрессии этих генов было связано с отсутствием непосредственного эффекта НАХТ [3, 4, 9]. Динамический процесс формирования

Связь экспрессии генов МЛУ и монорезистентности в опухолевой ткани легкого

с гистотипом и локализацией опухоли

МЛУ, о котором свидетельствует повышенный или сниженный уровень экспрессии генов МЛУ после химиотерапии, может являться универсальным механизмом лекарственной устойчивости опухолей многих локализаций в клинических условиях.

Заключение

Была изучена экспрессия генов МЛУ и монорезистентности в нормальной ткани бронхов и опухолевой ткани НМРЛ после проведения неоадъювантной химиотерапии по схеме винорельбин/ карбоплатин. Показан высокий уровень экспрессии некоторых генов МЛУ и монорезистентности в бронхах, по сравнению с опухолевой тканью, у больных T1-2 при аденокарциноме по сравнению с плоскоклеточным раком. Установлена тенденция к снижению уровня экспрессии генов МЛУ в опухоли больных с частичной регрессией по сравнению с опухолью больных со стабилизацией процесса, что соответствует нашим данным, полученным на опухоли молочной железы [3, 4, 9].

Работа поддержана грантом ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009–2013 гг.» соглашение № 8291 от 27 августа 2012 г.