Экспрессия Lag-3 на В-лимфоцитах как маркер прогноза ответа на терапию у больных хроническим лимфолейкозом

Хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) представляет собой В-клеточное лимфопролиферативное заболевание, характеризующееся накоплением в периферической крови, костном мозге, селезенке и других лимфоидных тканях небольших, зрелых опухолевых моноклональных лимфоидных клеток с иммунофенотипом В-лимфоцитов поздних стадий дифференцировки [1, 2]. Для опухолевых моноклональных В-лимфоцитов при ХЛЛ характерны: яркая экспрессия CD19, CD5, CD23, CD43; слабая экспрессия CD20 и CD22 и отсутствие экспрессии FMC7 [3–6]. ХЛЛ относят к чрезвычайно гетерогенным заболеваниям, течение которого может варьировать от индолентного, не проявляющего себя в течение ряда лет, до агрессивного, требующего незамедлительного начала терапии [7]. Одной из основных задач на момент установления диагноза и до начала лечения является поиск маркеров ответа больных на проводимую терапию и оценки риска прогрессирования заболевания [8, 9].

К наиболее известным прогностическим биомаркерам ХЛЛ относят время удвоения лимфоци- тов, уровень бета-2 микроглобулина, экспрессию CD38, ZAP-70, статус мутации гена тяжелой цепи иммуноглобулина (IgHV) и другие генетические аномалии [10–12]. Используют также международный прогностический индекс (ХЛЛ ‒ IPI), включающий 5 параметров: делеция/мутация 17p/ TP53; статус IgVH; уровень β2-микроглобулина сыворотки крови; возраст; стадию по Binet или Rai. С учетом этих показателей выделяют 4 группы риска: низкую, промежуточную, высокую и очень высокую [13]. Вместе с тем, системы стадирова-ния Rai и Binet не могут выступать единственным критерием прогноза. ПЦР, секвенирование или вестерн-блоттинг, используемые для выявления мутаций и делеций, остаются дорогостоящими, трудозатратными, длительными по времени выполнения методами, имеющими также целый ряд ограничений.

Стандартом терапии первой линии у больных ХЛЛ моложе 65–70 лет с хорошим соматическим статусом является режим FCR (флударабин-циклофосфамид-ритуксимаб) [14]. При невозможности проведения режима FCR альтернативным вариантом первой линии терапии может быть режим BR – комбинация бендамустина и ритук-симаба [15, 16].

Важнейшим этапом в оценке эффекта после завершения иммунохимиотерапии является количественная оценка минимальной остаточной болезни (МОБ). Минимальная остаточная болезнь – чувствительный и высокопрогностический суррогатный параметр ответа на терапию при хроническом лимфолейкозе, который позволяет прогнозировать выживаемость без прогрессирования и общую выживаемость за более короткий срок по сравнению с клиническим наблюдением [17]. Продемонстрировано, что МОБ является полезным маркером ответа на терапию, поскольку химиотерапия в сочетании с моноклональным антителом против CD20 ритуксимаб способны достигать необна-руживаемой MОБ при ХЛЛ [18–21]. Достижение МОБ-отрицательной полной ремиссии является независимым прогностическим фактором длительной выживаемости без прогрессирования и общей выживаемости. Остаточная популяция клеток ХЛЛ в крови <0,01 % свидетельствует о высокой вероятности длительной ремиссии более 5 лет; МОБ 0,01–0,90 % характеризует группу пациентов с медианой выживаемости без прогрессирования около 3 лет, что позволяет рассматривать возможность поддерживающей терапии; МОБ>1 % предвещает ранний рецидив и может служить основанием для смены терапии [22]. Эти данные указывают на необходимость поиска маркеров, позволяющих прогнозировать течение опухолевого процесса и ответ на терапию при мониторинге МОБ.

В современных условиях активно и всесторонне изучаются роль иммунных контрольных точек (ИКТ) в патогенезе хронического лимфолейкоза и возможности их использования в качестве прогностических маркеров. Наибольший интерес с этой точки зрения представляет белок LAG-3 (lymphocyte‐activation gene 3) или CD223, являющийся ингибирующим рецептором, впервые описанным в активированных in vitro Т-клетках [23]. Показано, что при ХЛЛ высокие уровни поверхностного и растворимого LAG-3 на опухолевых лимфоцитах связаны с более короткой медианой времени от постановки диагноза до начала первого лечения [24]. Установлена также корреляция повышенного уровня экспрессии LAG-3 на В-лимфоцитах с немутированным статусом вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина (UM-IGHV) и сниженной выживаемостью до прогрессирования у пациентов с ХЛЛ [25].

В этой связи изучение уровня экспрессии LAG-3 на лимфоцитах периферической крови во взаимосвязи с ответом больных ХЛЛ на проводимую противоопухолевую терапию при мониторинге МОБ, на наш взгляд, является перспективным для установления возможности его применения в качестве маркера прогноза.

Цель исследования ‒ изучить уровень экспрессии LAG-3 на В-лимфоцитах и возможность его применения в качестве маркера прогноза ответа на терапию у больных хроническим лимфолейкозом.

Материал и методы

В исследование включены 40 больных с впервые установленным диагнозом хронический лим-фолейкоз (24 мужчины, 16 женщин), находящихся под наблюдением в НМИЦ онкологии в период с 2019 по 2022 г. Средний возраст пациентов составил 66,8 ± 2,3 года. Больные разделены на 2 группы: группа I (n=10) – пациенты с ХЛЛ стадии A по J. Binet, которым не требовалось проведение специфической терапии; группа II (n=30) – пациенты с ХЛЛ стадии С по J. Binet, которым планировали проведение иммунохимиотерапии в двух режимах: 6 курсов по схеме RB (Ритуксимаб – 1 цикл: 375 мг/м2, внутривенно капельно, в 1-й день, последующие циклы: 500 мг/м2, внутривенно капельно или 1600 мг, подкожно, в 1-й день. Бендамустин – 90 мг/м2, внутривенно капельно, в 1, 2-й дни) или 6 курсов по схеме FCR (Ритуксимаб – 1 цикл: 375 мг/м2, внутривенно капельно, в 1-й день, последующие циклы: 500 мг/м2, внутривенно капельно или 1600 мг подкожно, в 1-й день. Флударабин – 25 мг/м2, внутривенно капельно, в 1–3-й дни. Циклофосфамид – 250 мг/м2, внутривенно капельно, в 1–3-й дни) [26].

Для определения количества оставшихся после терапии опухолевых В-лимфоцитов, которое невозможно оценить классическими морфологическими методами, исследовали уровень МОБ методом 10-цветной проточной цитофлюориметрии. В зависимости от схемы проводимой ИХТ выделены 2 группы: II-RB (n=12) и II-FCR (n=18), каждая из которых, в свою очередь, в зависимости от ответа больных на лечение была распределена еще на 2 подгруппы: IIА (n=19) – с хорошим ответом (МОБ – от 0,90 до 0 %); IIБ (n=11) – с неудовлетворительным ответом (МОБ>1 %). Таким образом, проведен анализ данных по 4 подгруппам больных: IIА-RB (n=8) и IIА-FCR (n=11), IIБ-RB (n=4) и IIБ-FCR (n=7). В контрольную группу вошли 20 человек, сопоставимых по возрасту и полу, без злокачественных новообразований.

Исходно во всех группах исследованы содержание В-лимфоцитов, их иммунофенотип с оценкой экспрессии LAG-3. Подсчет произведен в процентах от всех лимфоцитов. В группе II после 6-го курса ИХТ определена минимальная остаточная болезнь с применением цитофлуориметра Navios 10/3 (Beckman Coulter, США). Использованная комбинация моноклональных антител, меченных флюорохромами, включала: CD45 PB, CD19 ECD/PC7/APC, CD5 PC7/APC, CD10 PC5, CD20 PC5.5/PC7, CD22 PE, CD23 FITC/PE, CD38 FITC/PB, CD43 APC-A700, FMC7 FITC, CD3 PC7/

APC, CD223 PE, kappa FITC, lambda PE (Beckman Coulter, BD Biosciences, США). Для исследования взяты клетки венозной крови в растворе антикоагулянта К2ЭДТА. Результаты анализировали с применением программного обеспечения Kaluza v2.1 (Beckman Coulter, США). Стратегию гейтирования проводили в соответствии с международным стандартизованным протоколом [27].

Статистическую обработку данных выполняли в программе Statistica 13.0. Данные оценивали с использованием критерия Шапиро‒Уилка (для малых выборок). Выборки соответствовали нормальному распределению. Полученные результаты представлены в виде M ± m, где M – среднее арифметическое значение; m – стандартная ошибка среднего. Сравнение количественных данных в группах (независимые выборки) выполняли с использованием параметрического t-критерия Стьюдента. За уровень статистической значимости принимали p<0,05. Сбор клинической информации, биологического материала, соблюдение правовых норм и правил выполнены, согласно разработанным алгоритмам действий подразделений исследовательских и клинических групп ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России [28].

Результаты

В группах больных ХЛЛ по результатам им-мунофенотипирования обнаружена экспрессия LAG-3 на В-лимфоцитах (CD19+), которая отсутствовала в группе контроля (табл. 1, рис. 1). Обращало внимание, что уровень экспрессии LAG-3 на CD19+клетках у больных группы I был в 10 раз ниже, чем в группе II (p<0,001).

Эффект от проведенной терапии в группе II оценивали по результатам мониторинга МОБ (табл. 2). Определяли процент остаточной попу- ляции опухолевых В-лимфоцитов с иммунофенотипом CD19+/CD5+/CD23+. Отмечены различия в количестве МОБ после 6 курсов ИХТ у больных, пролеченных с использованием разных схем терапии (RB и FCR) и с различным ответом на лечение. Количественная характеристика МОБ в группе IIА с хорошим ответом в 12,1 раза меньше, чем в группе IIБ с неудовлетворительным ответом на лечение. Подтверждением хорошего ответа пациентов на терапию и при RB, и при FCR режимах ИХТ явились существенные различия в значениях МОБ между подгруппами: процент остаточной популяции опухолевых В-лимфоцитов в подгруппе IIА-RB в 81 раз меньше, чем в IIБ-RB, а в IIА-FCR ‒ в 112 раз меньше по сравнению с IIБ-FCR.

Особый интерес представляли результаты мониторинга МОБ у больных, получивших ИХТ в разных режимах. Так, в подгруппе IIA-FCR показатель МОБ в 4,5 раза был ниже значений в подгруппе IIA-RB (p<0,001). Вместе с тем, частота достижения хорошего ответа в подгруппе IIA-FCR была выше, чем в подгруппе IIA-RB, – у 57,9 и 42,1 % пациентов соответственно. Следует отметить, что только в подгруппе IIA-FCR в 36,4 % наблюдений отмечен МОБ-негативный статус, свидетельствующий об отсутствии в крови опухолевых В-лимфоцитов. В подгруппе IIБ-FCR показатель МОБ был в 3,2 раза меньше по сравнению с подгруппой IIБ-RB (p<0,001).

В связи с различным ответом на терапию проведен детальный анализ исходного уровня экспрессии LAG-3 у больных при разных режимах ИХТ: в IIA-RB, IIA-FCR, IIБ-RB, IIБ-FCR подгруппах (табл. 3). Обращает внимание, что независимо от схем проведенной терапии уровень экспрессии LAG-3 на CD19+клетках у больных группы IIА с хорошим ответом был в 2,8 раза ниже, чем у боль-

Рис. 1. Результаты иммунофенотипирования лимфоцитов крови методом проточной цитометрии. Точечные графики экспрессии LAG-3 на B-лимфоцитах (CD19): синим цветом выделена популяция клеток хронического лимфолейкоза CD19+/CD5+/CD23+; зеленым – нормальные В-лимфоциты CD19+/CD5-/CD23-; красным цветом обозначены остальные лимфоидные элементы Fig. 1. Immunophenotyping of blood lymphocytes by flow cytometry. Dot plots of LAG-3 expression on B-lympho-cytes (CD19). The population of cells of chronic lymphocytic leukemia CD19+/CD5+/CD23+ is highlighted in blue, normal B-lymphocytes CD19+/CD5-/CD23- are highlighted in green. Other lymphoid elements are marked in red

Òàблицà 1/Table 1

Уðîвåнь эêñпðåññии LAG-3 (CD223) нà B-лимфîцитàõ ó бîльныõ ÕЛЛ дî нàчàлà лåчåния, % îт лимфîцитîв

Level of LAG-3 (CD223) expression on B-lymphocytes in patients with CLL before treatment, % of lymphocytes

Обследованные группы/Study groups	n	CD19+/CD223+
Контроль/Control	20	0
Группа I/Group I	10	2,45 ± 0,56*
Группа II/Group II	30	24,62 ± 2,50*,**

Примечание: * – статистически значимые отличия от группы контроля (р<0,001); ** – статистически значимые отличия от больных группы I (р<0,001).

Note: * – statistically significant differences with the control group (p<0.001); ** – statistically significant differences with group I patients (p<0.001).

Òàблицà 2/Table 2

Êîличåñтвåннàя õàðàêтåðиñтиêà МÎБ в êðîви бîльныõ ÕЛЛ пîñлå 6-гî êóðñà ИÕÒ Quantitative characteristics of MRD in the blood of patients with CLL after the 6th course of ICT

Количественная характеристика МОБ на этапах обследования

(% от ЯСК остаточной популяции клеток ХЛЛ – CD19+/CD5+/CD23+)/

^{Группы больных/}                         Quantitative characteristics of MRD at the stages of the survey

^{Patient groups}                      (% of NC of the residual CLL cell population –CD19+/CD5+/CD23+)

	День 0/Day 0	После 6-го курса ИХТ/After the 6th course of ICT
IIА (n=19):	88,2 ± 1,13	0,15 ± 0,03*
IIА-RB (n=8)	87,3 ± 0,91	0,27 ± 0,02*
IIА-FCR (n=11)	90,4 ± 0,87	0,06 ± 0,02*, **
IIБ (n=11):	92,1 ± 1,26	12,25 ± 3,23*, ***
IIБ-RB (n=4)	89,3 ± 1,11	21,88 ± 6,22*, ****
IIБ-FCR (n=7)	92,6 ± 1,56	6,74 ± 1,76*,**, *****

Примечание: ЯСК – ядросодержащие клетки; * – значимые отличия МОБ от «день 0» (р<0,001); ** – значимые отличия МОБ при разных режимах ИХТ (р<0,05); *** – значимые отличия МОБ по сравнению с группой IIА (р<0,001); **** – значимые отличия МОБ по сравнению с группой IIА-RB (р<0,001); ***** – значимые отличия МОБ по сравнению с группой IIА-FCR.

Note: NC – nucleated cells; * – statistically significant differences between MRD and «day 0» (p<0.001); ** – statistically significant differences in MRD in different modes of ICT (p<0.05); *** – statistically significant differences in MRD in comparison with group IIA (p<0.001); **** – statistically significant differences in MRD in comparison with the IIA-RB group (p<0.001); ***** – statistically significant differences in MRD in comparison with the IIA-FCR group.

Òàблицà 3/Table 3

Уðîвåнь эêñпðåññии LAG-3 LAG-3 (CD223) нà B-лимфîцитàõ дî лåчåния ó бîльныõ ÕЛЛ ñ ðàзличным îтвåтîм нà ИÕÒ, % îт лимфîцитîв

Level of LAG-3 (CD223) expression on B-lymphocytes before treatment in CLL patients with different response to ICT, % of lymphocytes

Обследованные группы/Survey groups	CD19+/CD223+
IIА (n=19):	14,57 ± 0,66
IIА-RB (n=8)	16,73 ± 0,90
IIА-FCR (n=11)	13,01 ± 0,60*
IIБ (n=11):	41,95 ± 1,62**
IIБ-RB (n=4)	47,50 ± 1,66 ***
IIБ-FCR (n=7)	38,79 ± 1,12*, ****

Примечание: * – значимые отличия LAG-3 при разных режимах ИХТ (p<0,05); ** – значимые отличия LAG-3 по сравнению с группой IIA (p<0,001); *** – значимые отличия LAG-3 по сравнению с группой IIA-RB (p<0,001); **** – значимые отличия LAG-3 по сравнению с группой IIA-FCR (p<0,001).

Note: * – statistically significant differences in LAG-3 with different ICT regimens (p<0.05); ** – statistically significant differences in LAG-3 in comparison with the IIA group (p<0.001); *** – statistically significant differences in LAG-3 in comparison with the IIA-RB group (p<0.001);

**** – statistically significant differences in LAG-3 in comparison with the IIA-FCR group (p<0.001).

ных группы IIБ с неудовлетворительным ответом, и составил в среднем 14,57 ± 0,66 % и 41,95 ± 1,62 % соответственно (p<0,001). Также отмечены различия в уровне экспрессии LAG-3 и между подгруп-

пами, получающими одинаковую схему терапии, но с разным ответом. Так, в подгруппе IIА-RB экспрессия LAG-3 в 2,8 раза ниже значений в подгруппе IIБ-RB (p<0,001), а в подгруппе IIА-FCR в

3,0 раза ниже по сравнению с экспрессией LAG-3 в IIБ-FCR (p<0,001). Менее значительны различия в уровне экспрессии LAG-3 у больных, получивших ИХТ в разных режимах, но с одинаковым ответом на терапию. Так, экспрессия LAG-3 в подгруппе IIА-FCR в 1,3 раза ниже, чем в подгруппе IIА-RB (p<0,05), в подгруппе IIБ-FCR – в 1,2 раза ниже, чем в подгруппе IIБ-RB (p<0,05).

Обсуждение

В ряде исследований показано, что при ХЛЛ происходит нарушение регуляции LAG-3 на опухолевых В-клетках, связанное с повышением уровня поверхностной экспрессии этой молекулы [29, 30]. Учитывая известные к настоящему времени биологические свойства LAG-3 – угнетение апоптоза и стимуляция выживаемости клеток ХЛЛ при связывании с ними как растворимого, так и мембранного LAG-3 путем взаимодействия с экспрессированными на них молекулами MHCII, в чем могут также участвовать «истощенные» клетки иммунного микроокружения, гиперэкспрессирую-щие LAG-3 [24, 31, 32], – этот рецептор обоснованно считается одной из важнейших иммунных контрольных точек, антагонисты которых разрабатываются и исследуются как новые препараты для иммунотерапии [30, 33]. Описанная в литературе связь LAG-3 с другими молекулярными характеристиками опухолевых клеток, такими как мутация UM-IGHV , гиперэкспрессия PD-1/PD-L1 [17, 34, 35–38], предполагает более высокую эффективность комплексного воздействия на разные ИКТ. Негативное прогностическое значение LAG-3 при злокачественных опухолях, по-видимому, универсально, оно описано при раке молочной железы [39], меланоме [32], светлоклеточном раке почки [40], немелкоклеточном раке легкого [41], активно изучается при ХЛЛ [24, 25].

По результатам нашего исследования у больных ХЛЛ обнаружена экспрессия LAG-3 на поверхности CD19+клеток в отличие от здоровых лиц. При этом более высокий уровень экспрессии LAG-3 отмечен у больных группы II по сравнению с пациентами группы I. Кроме того, полученные данные демонстрируют отличия в уровне экспрессии LAG-3 у больных с разным ответом на проводимую терапию. Так, еще до начала лечения более высокий уровень экспрессии LAG-3 на CD19+клетках наблюдается у больных ХЛЛ стадии С по J. Binet,