Экспрессия микроРНК в опухолевой ткани у больных раком гортани

МикроРНК постранскрипционно регулируют генную экспрессию, связываясь с 3’-UTR мРНК генов-мишеней по принципу комплементарности, ингибируя или полностью инактивируя мРНК [3, 31]. Благодаря такому механизму микроРНК участвуют в регуляции многих клеточных процессов, включая развитие, дифференцировку, апоптоз, пролиферацию, ответ на стрессовое воздействие, метаболизм и секрецию инсулина [2].

В опухоли часто наблюдается аберрантная экспрессия микроРНК, которая свидетельствует о важной роли этих молекул в процессе канцерогенеза [12]. Аберрантная экспрессия микроРНК может быть следствием различных причин, таких как делеции, амплификации хромосомных локусов микроРНК, мутации или нарушение регуляции транскрипционных факторов, регулирующих экспрессию микроРНК. Влияние на микроРНК могут оказывать и эпигенетические механизмы [17, 23]. Экспрессия микроРНК отличается значительной тканевой специфичностью, и аберрантный паттерн экспрессии микроРНК различается в зависимости от тканевого происхождения опухоли. Описание этого аберрантного паттерна важно с точки зрения понимания механизмов канцерогенеза, поиска новых мишеней для таргетной терапии и маркеров для диагностики, прогноза и мониторинга заболевания. Одной из малоизученных локализаций в этом отношении являются плоскоклеточные карциномы гортани, которые по частоте заболеваемости занимают второе место в структуре опухолей головы и шеи

[8]. Среди микроРНК, для которых было проведено исследование аберрантного паттерна экспрессии в опухоли гортани, были выбраны те молекулы, относительно которых в литературе представлены данные, доказывающие их значительную роль в канцерогенезе при других локализациях. Это микроРНК-21, -18а, -200а, -200с, -205, -221, -494. Было показано, что они играют одну из ключевых ролей в регуляции процессов клеточного цикла, апоптоза, роста, инвазии, пролиферации клеток при опухолях репродуктивных органов у женщин (рак молочной железы, рак яичников), глиобластомах и многих других локализациях [9, 19, 20, 24].

Целью исследования явилось изучение аберрантного паттерна экспрессии микроРНК -18а, -21, -155, -200а, -200с, -205, -221, -494 в опухолевой ткани плоскоклеточной карциномы гортани относительно нормальной прилежащей ткани и связи этого показателя с клинико-морфологическими характеристиками опухолевого процесса.

Материал и методы

В исследование включены 46 больных раком гортани (табл. 1), мужского пола, в возрасте от 45 до 64 лет (в среднем – 56 ± 10 лет), проходивших обследование и лечение в Томском НИИ онкологии. Работа проведена с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан» (Указ президента РФ 39 от 24.12.93 № 2288), получено разрешение

таблица 1

Клинико-морфологические характеристики пациентов

Характеристика Число больных TNM I–II 24 (44 %) III–IV 31 (56 %) Лимфогенное метастазирование N0 43 (78 %) N1–3 12 (22 %) Степень дифференцировки Низкая 6 (13 %) Умеренная 32 (70 %) Высокая 4 (8,5 %) Нет информации 4 (8,5 %) локального этического комитета Томского НИИ онкологии.

В работе был использован парный операцион-ный/биопсийный материал (опухолевая и прилежащая нормальная ткань) от пациентов с первичным диагнозом плоскоклеточного рака гортани (РГ), не получавших на момент исследования специального лечения. Биопсийный материал из опухолевой и неизмененной ткани получали при видеоларингоскопии. Диагноз у всех пациентов был морфологически верифицирован. Биологический материал помещали в пробирки типа Eppendorf с консервирующим раствором RNAlater (Sigma, USA), пробирки выдерживали сутки при 4°С и потом хранили при –80°С до выделения РНК. Тотальная фракция РНК из ткани была выделена набором реагентов mirVana™ (Ambion, USA). Количество РНК и чистоту выделения оценивали на спектрофотометре NanoDrop 2000 (Thermo-Scientific, USA) (концентрация РНК варьировала от 30 до 800 нг/ мкл, А260/280=1,90). Значение RIN (RNA Integrity Number) колебалось от 8,0 до 9,4 (оценивали на приборе TapeStation 2200 Agilent Technologies, USA). Мультиплексная обратно транскриптазная ПЦР (ОТ-ПЦР) проводилась в объеме 20 мкл, в состав которого входили 100–500 нг РНК-матрицы, 0,5 нM микроРНК-специфичного праймера особой шпилевидной конструкции (hsa-miR-18a-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-155-5p, hsa-miR-200a-3p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-221-3p, hsa-miR-494-3p) [18], 1 ед. ингибитора РНКаз, 50 ед. MMLV ревертазы («Сибэнзим», Новосибирск), 1x MMLV буфера и 1 мM каждого dNTP. Протокол реакции: 38 циклов при 16°C в течение 20 сек, при 42°C в течение 20 сек, при 50°C в течение 1 сек, с заключительным этапом прогрева смеси при 85°C в течение 1 мин. При каждой постановке были включены отрицательные контроли, не содержащие РНК и/или несущие в составе геномную ДНК. Все реакции ПЦР в режиме реального времени проведены в триплете согласно протоколу [18]. В качестве гена-рефери выбрана микроРНК-103 [26], калибровка выполнена относительно прилежащей к опухоли нормальной ткани у каждого пациента, уровень экспрессии микроРНК рассчитан согласно методу Pfaffl [27]. В качестве результата использовано логарифмически трансформированное по основанию е нормализованное значение уровня экспрессии (ln(fold+const)).

Корреляционный анализ, а также обработка данных с применением t-критерия Уэлша и Стьюдента проводились в программе Statistica 8.0. Для всех статистических подсчетов применен критерий множественности сравнения Бенджамини – Хох-берга (FDR – false discovery rate). Все значения р, удовлетворяющие условию FDR ≤ 5 %, принимались как статистически значимые.

Результаты исследования

На первом этапе было изучено возможное влияние на экспрессию микроРНК таких параметров, как стадия распространенности процесса, статус лимфогенного метастазирования и степень дифференцировки опухоли путем сравнительной оценки показателей уровня экспрессии микроРНК в подгруппах. Ввиду малочисленности выборки были объединены пациенты с I–II и III–IV стадиями опухолевого процесса. Сравнение этих групп не выявило значимых различий в уровне экспрессии анализируемых микроРНК. Не обнаружено влияния лимфогенного метастазирования и степени дифференцировки опухолевой ткани на экспрессию анализируемых микроРНК (табл. 2). Хотя для микроРНК-200с показано снижение уровня экспрессии у пациентов без метастазирования в сравнении с подгруппой лиц с лимфогенными метастазами, для микроРНК-18а наблюдается тенденция к повышению уровня экспрессии от низкой к высокой степени дифференцировки опухоли. Однако с учетом поправки FDR данные значения р не являются статистически значимыми (табл. 2). Таким образом, клинико-морфологические параметры не оказывали статистически значимого влияния на экспрессию микроРНК в опухолевой ткани гортани. Это позволило анализировать аберрантный паттерн экспрессии микроРНК в общей группе.

Установлено, что для некоторых микроРНК выявлен аберрантный уровень экспрессии в опухолевой ткани относительно прилежащей нормальной ткани пациентов. Показана статистически значимая гиперэкспрессия микроРНК-21, -155 и -205 (р=0,00005, р=0,00008 и р=0,00085 соответственно). Частота встречаемости случаев с гиперэкспрессией по этим микроРНК в 2,3–4,8

таблица 2

Уровень экспрессии микрорнК в опухоли относительно прилежащей нормальной ткани пациентов в зависимости от клинико-морфологических параметров

Параметры	МикроРНК	-18а	-21	-155	-200а	-200с	-205	-221	-494
Распространенность первичной опухоли	Т	0,20 ± 0,21	0,64 ± 0,27	0,67 ± 0,33	-1,05 ± 0,30	-0,22 ± 0,19	0,50 ± 0,15	-0,70 ± 0,32	-0,29 ± 0,39
	Т	0,26 ± 0,15	1,27 ± 0,33	0,84 ± 0,17	-0,69 ± 0,36	-0,01 ± 0,30	0,81 ± 0,39	0,06 ± 0,31	0,09 ± 0,33
	р	0,15	0,66	0,45	0,56	0,46	0,09	0,46	0,83
	FDR	58,3	75,2	119,7	74,2	74,1	74,2	91,3	82,9
Лимфогенное метастазирование	N0	0,16 ± 0,14	0,85 ± 0,24	0,72 ± 0,21	-0,82 ± 0,28	-0,35 ± 0,20	0,63 ± 0,25	-0,27 ± 0,24	-0,11 ± 0,32
	N 1-2	0,26 ± 0,23	1,82 ± 0,57	1,04 ± 0,37	-0,82 ± 0,50	0,87 ± 0,46	0,53 ± 0,49	-0,35 ± 0,76	0,04 ± 0,25
	р	0,696	0,123	0,449	0,993	0,018	0,858	0,923	0,717
	FDR	139,2	49,2	119,8	99,3	14,5	114,5	105,5	114,8
Степень дифференцировки опухоли	Низкая	0,29 ± 0,18	0,87 ± 0,68	0,61 ± 0,39	-0,60 ± 0,51	-0,65 ± 0,62	0,37 ± 0,61	0,15 ± 0,11	-1,14 ± 1,05
	Умеренная	0,31 ± 0,15	0,97 ± 0,27	0,74 ± 0,22	-0,91 ± 0,31	-0,1 ± 0,221	0,69 ± 0,28	-0,40 ± 0,31	0,07 ± 0,28
	Высокая	0,68 ± 0,57	0,34 ± 0,68	0,62 ± 0,70	-0,94 ± 0,70	0,19 ± 0,20	0,47 ± 0,38	-0,38 ± 0,30	-0,06 ± 0,53
	р1	0,01	0,89	0,77	0,6	0,41	0,63	0,1	0,27
	FDR, %	12	89,4	88,5	95,9	82,8	84,6	39,7	72,9
	р2	0,14	0,59	0,99	0,7	0,23	0,9	0,14	0,39
	FDR, %	57,6	94,8	99,2	93,7	61,9	102,5	112,8	77,3
	р3	0,53	0,39	0,87	0,97	0,32	0,64	0,97	0,83
	FDR, %	141,8	156,9	115,9	97,3	257	127,7	110,7	132,4

Примечание: р – уровень значимости рассчитан по t-критерию Уэлша; р1 – «низкий» vs «умеренный», р2 – «низкий» vs «высокий», р3 – «умеренный» vs «высокий»; FDR – поправка Бенджамини–Хохберга (FDR – false discovery rate).

таблица 3

Уровень экспрессии микрорнК в опухоли относительно прилежащей нормальной ткани

МикроРНК	Уровень экспрессии	р	FDR	Число случаев с гиперэкспрессией	Число случаев с гипоэкспрессией
-18а (n=45)	0,23 ± 0,83	0,071	11,39	27 (61 %)	18 (39 %)
-21 (n=46)	0,98 ± 1,49	0,00005	0,04	38 (83 %)	8 (17 %)
-155 (n=46)	0,76 ± 1,19	0,00008	0,03	34 (74 %)	12 (26 %)
-200а (n=46)	-0,85 ± 1,61	0,0008	0,22	14 (30 %)	32 (70 %)
-200с (n=46)	-0,11 ± 1,24	0,569	65,05	21 (45 %)	25 (54 %)
-205 (n=44)	0,66 ± 1,43	0,003	0,75	37 (81 %)	9 (19 %)
-221 (n=43)	-0,31 ± 1,48	0,174	23,24	25 (54 %)	21 (46 %)
-494 (n=43)	-0,08 ± 1,64	0,762	76,21	22 (43 %)	26 (56 %)

Примечание: р – уровень значимости рассчитан по t-критерию Стьюдента (t-for single means); FDR – поправка Бенджамини–Хохберга.

раза выше, чем гипоэкспрессии. Кроме повышенной экспрессии, для микроРНК-200а отмечается гипоэкспрессия (р=0,0008), и частота случаев с гипоэкспрессией микроРНК-200а в 4,3 раза выше, чем частота гиперэкспрессии (табл. 3).

Для микроРНК, как и для многих молекулярных регуляторов клетки и организма в целом, характерно образование сложной системы взаимодействий друг с другом [14, 32]. На основе корреляционного анализа была показана такая сеть взаимодействий для изученных микроРНК (рис. 1). Выявлена положительная корреляция для микроРНК-21 и -155 (r=0,31, р=0,00001), микроРНК-200с и -18а (r=0,38, р=0,001), 200с и -205 (r=0,34, р=0,025), -200а и -221 (r=0,35, р=0,021) (рис. 1), а также наблюдается тенденция к положительной корреляции между микроРНК-21 и -200с (r=0,31, р=0,036), однако значение р не удовлетворяет 5 % поправке FDR.

Обсуждение

Полученные нами результаты по гиперэкспрессии микроРНК-21, -155 и -205 в опухоли гортани согласуются с данными литературы. J. Ren et al. [29] и P. Cao et al. [5] выявили гиперэкспрессию микроРНК-21 при раке гортани. Результаты по микроРНК-155 при злокачественных опухолях головы и шеи частично соотносятся с данными литературы, имеются отдельные работы, в которых показаны как гиперэкспрессия [6, 16], так и отсутствие значимых изменений ее экспрессии в опухолевой ткани [5]. В целом данные относительно экспрессии микроРНК-205 при раке гортани противоречивы. P. Cao et al. [5] выявили значимую гиперэкспрессию микроРНК-205, однако L. Tian et al. [30] в исследованиях in vitro (культура Hep-2 клеток) и in vivo (n=30) обнаружили гипоэкспрессию этой микроРНК при раке гортани, что авторы

Рис. 1. Корреляционные связи между показателями экспрессии изучаемых микроРНК в опухолевой ткани у больных РГ

объясняют возможными влияниями выбора гистотипов опухоли, ее подтипов, микроокружения и регуляции генов-мишеней. Результаты исследования и данные литературы позволяют предполагать, что микроРНК-21, -155 и -205 играют онкогенную роль при опухолях гортани, и повышение их экспрессии связано с регуляцией различных процессов, задействованных в канцерогенезе.

Онкогенную функцию этих микроРНК подтверждает список генов-мишеней, экспрессию которых регулируют данные микроРНК. В настоящее время для микроРНК-21 валидированы следующие мишени: PDCD4 (programmed cell death protein 4), RECK (reversion inducing cysteine-rich protein with kazal motifs), maspin (mammary serine protease inhibitor), NFIB (nuclear factor I), TPM1 (Tropomyosin 1), SPRY2 (Sprouty2), PTEN (phosphatase and tensin homologue), Tap63 (transformation-related protein 63), лиганд Fas, Cdc25a (cyclin-dependent kinases 25), HNRPK (Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K). Все перечисленные гены-мишени микроРНК-21 принимают непосредственное участие в трансформации клеток [15, 20].

МикроРНК-155 принимает участие в регуляции нескольких ключевых процессов канцерогенеза через ингибирование генов-мишеней, задействованных в TGF-β/Smad-индуцированном эпителиально-мезенхимальном переходе, гликолизе, JNK2/STAT3 пути, NF-kB и AKT путях. Представлены убедительные доказательства того, что мишенями этой микроРНК являются: FOXO3a (Forkhead box O3), C/EBPβ (CCAAT-enhancer-binding proteins), которая, в свою очередь, активирует экспрессию hexokinase 2, STAT3 (Signal Transducer and Activator of Transcription), действие которого проявляется через репрессию гена SOCS1 (suppressor of cytokine signaling 1), CDC73 (Cell division cycle 73) и ряд других [7].

Относительно микроРНК-205 отмечается ее дуалистическая роль в канцерогенезе. Онкосу- прессорную роль микроРНК-205 осуществляет путем подавления пролиферации при ЗНО, репрессируя экспрессию таких генов-мишеней, как ErbB3 (Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3), E2F1(Transcription factor E2F1) и гены MAPK- и AR-сигнальных путей, PKCε (Protein kinase C epsilon type), ZEB1/2, ММР2 и ММР9, VEGF-A (Vascular endothelial growth factor). Имеются сообщения, свидетельствующие и об онкогенной роли микроРНК-205, которая участвует в малигнизации, прогрессии опухоли и развитии устойчивости к противоопухолевой терапии, репрессируя гены PTEN, CYR61 (Cysteine-rich angiogenic inducer 61) и CTGF (connective tissue growth factor), SHIP2 (enzyme phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate 5-phosphatase), DHFR (Dihydrofolate reductase) [28].

Наши результаты относительно гипоэкспрессии микроРНК-200а при раке гортани согласуются и дополняют полученные ранее данные других авторов, которые показали онкосупрессорную роль этой микроРНК в канцерогенезе опухолей разных локализаций [13]. Для микроРНК-200а валидированы такие гены-мишени, как: ZEB1 и 2 (Zinc finger E-box-binding homeobox 1 и 2) [25], ERRFI-1 (ERBB receptor feedback inhibitor 1) [1], CTNNB1 (cadherin-associated protein) [22] и ряд других. Эти данные позволили заключить, что микроРНК-200а играет ключевую роль в эпителиально-мезенхимальном переходе и процессе приобретения клеткой эмбрионального фенотипа [4, 19].

Результаты корреляционного анализа могут свидетельствовать о наличии связи между этими микроРНК, в основе которой лежит их вовлеченность в процессы внутриклеточной регуляции общих генов-мишеней. Такие гены-мишени найдены для всех связанных пар. МикроРНК-21 и -155 объединяет в первую очередь их взаимодействие с сигнальным белком и активатором транскрипции STAT3 [21]. На микроРНК-18а и -200с оказывает влияние репрограммирующий фактор c-Myc [10]. МикроРНК-200с и -205 играют определенную роль в эпителиально-мезенхимальном переходе и процессе приобретения клеткой эмбрионального фенотипа посредством регуляции экспрессии генов ZEB1 и ZEB2 [13]. Пары микроРНК-221 и 200а могут быть связаны через ген р27Kip1, который играет существенную роль в регуляции перехода от G1 к S-фазе клеточного цикла [11].

Заключение

Таким образом, установлены гиперэкспрессия онкогенных микроРНК-21, -155, 205 и гипоэк- спрессия онкосупрессорной микроРНК-200а в опухолевой ткани гортани пациентов с первичным диагнозом рака гортани, что согласуется с данными литературы, полученными для этих микроРНК на примере других локализаций. Эти данные позволяют предположить значительную роль микроРНК21, -155, -200а и -205 в канцерогенезе опухолей гортани, что, вероятно, связано с их участием в регуляции многих генов-мишеней и клеточных процессов, задействованных в малигнизации.

Работа выполнена в рамках программы повышения конкурентоспособности Национального исследовательского Томского государственного университета.