Экспрессия молекулярных маркеров при наружном генитальном эндометриозе

Актуальность проблемы

Эндометриоидная болезнь и ее рецидивирование является актуальнейшей медико-социальной и медико-экономической проблемой современной гинекологии, оказывающей негативное влияние как на качество жизни пациенток, так и репродуктивный потенциал нации в целом. В настоящее время в этой области перед современной медициной стоит множество проблем, включающих вопросы усовершенствования диагностики и лечения этого заболевания[1].

Одним из самых изученных биомаркеров эндометриоза является СА-125, являющийся гликопротеином, вырабатыва- емым клетками серозных злокачественных опухолей яични-ков[2]. Впервые данный антиген был описан в 1981 году как антиген серозного рака яичников. Еще в 1998 было показано, что диагностическая ценность данного маркера существенно возрастает на тяжелых (III-IV) стадиях эндометриоза [2]. Данная гипотеза была подтверждена другими исследованиями. Несмотря на давнюю историю изучения, современные исследования также подтверждают диагностическую значимость этого онкомаркера особенно в сочетании случаев аденомиоза с пролиферативной патологией эндометрия [3].

Буквально рубежом современной науки является изучение так называемых микроРНК - малых некодирующих молекул РНК длиной 18-25 нуклеотидов, которые участвует в транскрипционной и посттранскрипционной регуляции экспрессии различных генов. Доказано непосредственное участие молекул микроРНК в регуляции экспрессии различных генов. По-видимому, непосредственно микроРНК скорее ответственны за подавление процессов экспрессии генов, подавляя трансляцию белка на рибосомах [4].

В то же время уже сегодня микроРНК может играть важную роль в клинике, будучи биомаркером различных заболеваний. С целью лучшего понимания патофизиологии различных заболеваний многие авторы исследовали экспрессию микроРНК при различных заболеваниях, в том числе сердечно-сосудистых, онкологических, гинекологических [5].

Первое крупное исследование, посвященное экспрессии различных типов микроРНК при эндометриозе было проведено в 2009 году и выделило 14 типов микро РНК с повышенной экспрессией и 8 со сниженной [6].

Точками приложения микроРНК являются многие мишени, включая острофазный стероидогенный регуляторный белок (StAR), CYP19A1, ЦОГ-2, ERα, ERβ, PR [7]. Некоторые группы исследователей изучали потенциальную роль микроРНК в патогенезе развития эндометриоза. Как уже обсуждалось выше, патогенез развития эндометриоидных очагов связан с такими процессами, как ангиогенез, пролиферация и миграция клеток, ремоделирования межклеточного матрикса. Все группы ученых сходятся во мнении, что микроРНК регулируют эти процессы. Существуют исследования, показавшие различную экспрессию микроРНК при исследовании эндометриоидных гетеротопий и эутопического эндометрия [6]. В одной работе было показано нарушение экспрессии 22 микроРНК в эндометриоидных гетеротопиях, при этом микроРНК-29 отводится ключевая роль в развитии эндометриоза [7,8]. Таким образом, дисфункция или мутация этих молекул может служить причиной развития эндометриоза[8]. При этом функции конкретных подтипов микроРНК и роль каждого из них в патогенезе эндометриоза остается неизученной.

В свете сказанного проводятся исследования, направленные на сравнение экспрессии микроРНК у здоровых женщин и пациенток с эндометриозом [9].

Именно поэтому перед наукой встает задача поиска определенных биомаркеров, т.е. определенных индикаторов, по наличию или уровню которых возможно предсказывать состояние как всего организма в целом, так и регистрировать наличие какого-либо заболевания.

До настоящего времени исследования, посвященные поиску биомаркеров рецидива эндометриоза, довольно немногочисленны. В то же время, следует понимать, что именно поиск специфических маркеров как заболевания, так и его рецидива способен дать ответ на многие вопросы формирования представлений о развитии заболевания и поисках оптимального лечения.

Целью исследования явилось определение особенности экспрессии микроРНК у пациенток с наружным генитальным эндометриозом.

Материал и методы исследования

Исследованы 33 образца плазмы крови пациенток с III-IV стадиями и 33 образца плазмы крови пациенток с I-II стадиями наружного генитального эндометриоза, а также 10 образцов плазмы здоровых женщин в качестве отрицательного контроля. Все пациентки после операции согласно классификации R-AFS (Revised Classification of American Fertility Society, 1985) были разделены на две группы, формирование которых производилось ретроспективно, после оперативного лечения. Контрольная группу составили женщины аналогичного возраста без эндометриоза. Диагноз НГЭ в обеих группах был верифицирован лапароскопическим и морфологическим исследованием.

Критерии включения: наружный генитальный эндометриоз (N80.1-эндометриоз яичников), лапароскопически и морфологически подтвержденный диагноз, репродуктивный возраст.

Критерии исключения: наличие эндометриоза других локализаций, наличие сопутствующих гинекологических заболеваний воспалительной и невоспалительной этиологии, злокачественные опухоли органов репродуктивной системы.

Отбор кандидатов среди микроРНК с потенциальными клиническими свойствами для исследования, был осуществлен на основе литературных данных. В результате мы отобрали 6 наиболее дисрегулированных микроРНК для дальнейшего изучения на нашей выборке пациентов, которая включала в себя 33 образца плазмы крови пациентов с III-IV стадиями и 33 образца плазмы крови пациентов с I-II стадиями эндометриоза, а также 10 образцов плазмы здоровых доноров в качестве отрицательного контроля.

МикроРНК	Номер по базе данных miRBase
hsa-mir-155-5p	MIMAT0004658
hsa-miR-30c-5p	MIMAT0000244
hsa-miR-133a-5p	MI0000450
hsa-miR-574-3p	MIMAT0003239
hsa-mir-425-5p	MIMAT0003393
hsa-mir-625-3p	MIMAT0004808

Кровь пациентов отбиралась до операции, в вакуумные пробирки (7-9 мл), содержащие ЭДТА в качестве антикоагулянта. Цельную кровь центрифугировали при температуре +4°С в течении 20 минут при оборотах 300G, в течении 30 минут после забора. Центрифугирование производилось с использованием центрифуги 5810 R (Eppendorf). Затем плазму переносили в микроцентрифужные пробирки и подвергали повторному центрифугированию при температуре +4°С в течении 10 минут при оборотах 14000G. Очищенную от клеточного дебриса плазму отбирали в 2мл пробирки типа Эппен-дорф и хранили при температуре -80°С.

Предварительно концентрацию полученной РНК измеряли на спектрофотометре NanoDrop 1000 (NanoDrop Technologies Inc., USA). Исходя из полученных данных, проводили более точную оценку при помощи флуориметра «Quibit 2.0» (Thermo Fisher Scientific, США). Такой тип анализа позволяет при помощи специфического красителя, способного в смеси различных нуклеиновых кислот связываться только с РНК. Это свойство позволяет провести максимально точную количественную оценку. Качество выделенной РНК проводили на биоанализаторе Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, США).

Оценивали параметр ΔCt, который представляет собой разность значений порогового цикла (Ct) между целевым и контрольным генами, то есть проводили вычитание значения Ct референса (в нашем случае значение Ct эндогенного контроля U6), из каждой интересующей микроРНК, по следующей формуле: ΔCt = Ct(miRNA интереса) – Ct(U6). Данная часть работы была выполнена на базе лаборатории ЦКП «Геном»

Статистический анализ проводился при помощи оригинального программного приложения АТГ (Анализ Транскрипции Генов), разработанного в ИМБ РАН (свидетельство о регистрации №2008612585, Роспатент), позволяющего рассчитывать и эффективность амплификации, а также учитывать ее при определении значения порогового цикла Ct. Для оценки ассоциации между уровнями экспрессии микроРНК в пределах одних и тех же образцов рассчитывали коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Для значений p (как при расчёте корреляций Спирмена, так и при оценке изменений уровня экспрессии тестом Уилкоксона) была введена поправка на множественное тестирование Бенджамини-Хохберга (FDR). Данные считали достоверными при p < 0.05.

Результаты исследования

Средний возраст женщин в основной группе составил 30,3±4,5 года, в контрольной – 29,8±3,9 года. – повышение уровня относительной экспрессии микроРНК-30с в группе с эндометриозом, в сравнении с контрольной группой в 2 раза (p <0.05);

В большей части госпитализированных больных (88,3%) была выполнена резекция яичников, причем практически половине больных (43,3%) – левосторонняя, четверти пациенток (25,0%) – правосторонняя.

У пятой части пациенток (20,0%) эндометриоидные кисты были выявлены в обеих яичниках, что явилось основанием для проведения резекции яичников с обеих сторон. Причем среди пациенток с наружным генитальным эндометриозом III – IV степени выраженности эндометриоидные кисты достоверно чаще диагностировались в левом яичнике (p <0,05).

Практически у половины оперированных больных (46,7%) интраоперационно был диагностирован спаечный процесс II-IV ст., в связи с чем, оперативное вмешательство было дополнено сальпингоовариолизисом. Причем если разделение спаек в области левых придатков проводилось у пятой части пациенток (21,7%), то сальпингоовариолизис справа – достоверно реже – только у 10,0% больных.

В результате нашего исследования было показано, что относительный уровень экспрессии микроРНК-30с и микроРНК-133а повышается при эндометриозе по сравнению с контролем, в то время как микроРНК-155, микроРНК-574* и микроРНК-425 демонстрируют понижение относительного уровня экспрессии. Поскольку при эндометриозе наблюдаемые изменения экспрессии ассоциированы с наличием или отсутствием заболевания, они позволяют рассматривать данные молекулы в качестве потенциальных диагностических маркеров эндометриоза.

При сравнительном анализе относительного уровня экспрессии микроРНК-625* между группой больных эндометриозом и контрольной группой, не было выявлено различий. В ходе настоящего исследования установлено:

• -    понижение уровня относительной экспрессии микроРНК-155 в группе с эндометриозом в сравнении с контролем в 1,16 раза (p <0.05);

• -    не было выявлено различий в экспрессии микроРНК-625* между изучаемыми группами (p <0.05);

• -    понижение уровня относительной экспрессии микроРНК-574* в группе с эндометриозом, относительно контрольной группы в 1,37 раза (p <0.05);

• -    повышение уровня экспрессии микроРНК-133а в группе с эндометриозом относительно контрольной группы в 1,17 раза (p <0.05);

• -    понижение уровня относительной экспрессии микроРНК-425 в группе с эндометриозом в сравнении с контролем в 1,5 раза (p <0.05).

Следует отметить, что литературные данные о возможности использования микроРНК в качестве диагностических маркеров, а также для стратификации эндометриоза по степени тяжести, крайне противоречивы[9]. Часто в различных работах результаты приведены в разных единицах измерения, что существенно затрудняет сопоставление количественных данных оценки относительного уровня экспрессии микроРНК[8,9]. Это усугубляется незначительными отличиями в уровне экспрессии между сопоставляемыми группами образцов. Таким образом, единственным способом решения проблемы является оптимизация набора индивидуальных маркеров для создания диагностической панели, обеспечивающей увеличение показателей чувствительности и специфичности. Выявленные нами потенциальные маркеры обладают недостаточно индивидуальной предсказательной силой, хотя и продемонстрировали в рамках нашего исследования статистически достоверные различия при сравнении групп. Таким образом, эти микроРНК могут быть рекомендованы только как компоненты диагностической панели.

По результатам проведенного исследования, можно сделать вывод, что развитие малоинвазивного диагностического тестирования с использованием микроРНК, имеет большой потенциал. Дальнейшие исследования в области идентификации и анализа экспрессии циркулирующих микроРНК, как потенциальных маркеров для диагностики эндометриоза и степени его тяжести, с использованием расширенной выборки пациентов, а также с применением новейших высокоточных и высокочувствительных молекулярно-генетических методов (высокопроизводительное секвенирование и цифро-вая-капельная ПЦР), приведут к разработке надежной диагностической панели.

Вывод

Таким образом, на основе количественной оценки содержания циркулирующих микроРНК, можно рекомендовать микроРНК-30с, микроРНК-155, микроРНК-574*, микроРНК-425, микроРНК-133а для включения в состав диагностической панели эндометриоза.